葵花粕中绿原酸检测方法的建立

胡鲜宝，吕加平，刘 鹭，范贵生，张书文，闫 坤，谢跃杰

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

葵花粕中绿原酸检测方法的建立

胡鲜宝1，2，吕加平1，*，刘 鹭1，范贵生2，张书文1，闫 坤1，谢跃杰1

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京100193；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018）

在分析高效液相色谱法（HPLC）和紫外分光光度法（UV）的基础上，通过运用Origin8.0数据处理分析软件，建立了一种快速、有效、准确的葵粕绿原酸（CGA）检测方法。结果表明：这两种方法测定的已知浓度CGA的含量符合方程：Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3，R2=0.9856，其中X为UV测定结果，Y为HPLC测定结果，并通过验证，在5.5～33μg/mL浓度范围内，该方程准确可靠，从而可以实现UV法快速、准确地测量大批量样品中的CGA含量。

绿原酸，UV法，HPLC法，检测

绿原酸（CGA）又名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸过程中产生的一种由咖啡酸（caffiec acid）与奎尼酸（quinic acid）组成的酯类物质［1］，分子式C16H18O9，分子量345.30［2］。绿原酸具有较强的药理活性，它具有预防II型糖尿病和心血管疾病的功能［3-4］。而且据报道，绿原酸有抗病毒、抗细菌和抗真菌作用，并且毒副作用较低［5-7］。绿原酸主要存在于杜仲叶、金银花和向日葵中，据报道向日葵栽培品种中绿原酸含量为1.1%～4.5%，平均为2.8%［8］，我国有丰富的葵粕资源，对葵粕中绿原酸进行研究，不仅可以促进向日葵资源的综合开发利用，而且可解决向日葵产区葵粕积压问题。随着对CGA研究广泛、深入的开展，进行CGA分析检测是各项研究开展的前提和基础。目前国内外定性和定量分析CGA的方法主要有紫外分光光度法（UV）、高效液相色谱法（HPLC）、荧光光度法、薄层色谱扫描法和毛细管电泳法（CE），其中UV法和HPLC法是最为常用和经典的分析方法。HPLC法具有高灵敏度、高准确度和高分离效果，但是比较费时并且费用较高，不适合常规检测。UV法价格便宜，操作简便快速，国内有好多学者利用UV分析CGA，但是该法易受各种杂质的干扰，造成测定结果误差较大。因此，亟待建立一种客观、快速、简便的测定方法，本研究试图采用UV和HPLC相结合的方法对CGA含量进行测定，并通过曲线拟合，建立数学模型，用HPLC测定的结果对UV进行修正，为后续研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葵花仁 内蒙古恒信商业有限责任公司；石油醚 天津市永大化学试剂开发中心；乙醇 北京化工厂；去离子水 中国农业大学；绿原酸标准品Sigma公司。

UV2300紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；6410液相色谱-质谱连用仪 配有电喷雾离子源（ESI），美国Agilent科技公司；Anke LXJ-IIB离心机 上海安亭科学仪器厂；DK-S24型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；JA2003N电子天秤 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葵粕中绿原酸的提取 葵花籽→粉碎→浸提去油→湿粕低温干燥→醇提→过滤→离心→检测

1.2.2 最大吸收波长的测定 将绿原酸标准溶液配制成浓度为 0.05mg/mL，用紫外分光光度计在200～1000nm扫描，由计算机读出最大吸收波长。

1.2.3 液质连用（HPLC-MS）对提取物中的绿原酸进行定性分析

1.2.3.1 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18（2.1× 30mm，3.5μm）；柱温：35℃；进样量：2μL；流动相：0.5%乙酸溶液∶乙腈=90∶10。

1.2.3.2 质谱条件 电喷雾电离源（ESI）；负离子检测；流速：0.3mL/min；喷雾压力：120V；扫描方式（SIM模式）；m/z：354。

1.2.4 绿原酸紫外检测方法的建立

1.2.4.1 标准曲线的制备 精密称定绿原酸标准品5mg，用95%乙醇定容到50mL，摇匀后，取0.5、0.75、1.0、1.25、2.0、2.5mL分别置于10mL容量瓶中，并且用95%乙醇稀释到刻度。以95%乙醇为参比液，在327nm处测定各浓度的吸光值A。以绿原酸标准品浓度C为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘图，得回归方程。

1.2.4.2 回收率的测定 在样品制备液中加入一定浓度的绿原酸标准溶液，在已经测定的最大吸收波长处测定吸光度OD，根据回归方程计算回收率。B=A1/A2（式中：B-回收率，A1-实测量，A2-加入量）采用加样回收法。取适量已知含量的同一批号样品，分别精密加入一定量的绿原酸对照品，依方法操作测定，同法重复实验5次，测得绿原酸的平均回收率。

1.2.5 绿原酸高效液相色谱检测方法的建立

1.2.5.1 液相色谱条件 色谱柱：C18柱（250mm× 4.6mm，5μm）；流动相：0.5%乙酸溶液∶乙腈=90∶10；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测波长：327nm；进样量：10μL。

1.2.5.2 标准曲线方程 称取绿原酸标准品0.02g（精确至0.0001g）于100.0mL容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，混匀，此标准使用液在4℃冰箱中储存，分别吸取此标准使用液，用流动相稀释并在容量瓶中定容的浓度分别为 2.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg/mL标准系列，以绿原酸标准品浓度C为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘图，得回归方程。

1.2.5.3 回收率实验 采用1.2.4.2所用回收率测定方法。

1.2.6 拟合方程的建立 在UV检测方法和HPLC检测方法的基础上，以CGA标准品为检测样品，通过运用Origin8.0数据处理分析软件，建立UV测定结果与HPLC测定结果之间的数学模型。

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的测定

在200～1000nm对CGA标准品扫描，从图1可以看出，CGA在327nm处有最大吸收峰。

2.2 绿原酸定性分析

为了对提取物中的绿原酸进行定性分析，采用负离子检测，建立绿原酸定性分析方法，其质谱采用SIM模式，在m/z为354处有比较强的响应，根据其质谱特征，可以判断该组分为绿原酸，图2和图3分别为葵粕提取液和标准品SIM谱图。

图1 标准液UV扫描图

图2 葵粕绿原酸提取液SIM图谱

图3 绿原酸标准品SIM谱图

2.3 UV法对CGA的测定

根据朗伯比尔定律，在一定浓度范围内吸光度值与样品浓度成正比，由图4可知，CGA浓度在0.01～0.03mg/mL时有良好的线性关系，并求得线性回归方程为Y=0.0169X+0.0002，R2=0.9952。通过表1可知UV法的平均加样回收率为1.16%，可见UV法具有一定的准确度。

图4 UV法测CGA标准曲线

表1 UV法CGA回收率表

2.4 HPLC法对CGA的测定

通过计算得HPLC法测定葵花粕中CGA线性方程为：Y=0.09946+0.22857X，R=0.99984，方程显著性水平是0.0001。并且由图5可知，CGA在2～80μg/mL的浓度范围内是线性相关的，并且具有良好的线性关系。通过表2可知，HPLC法的平均加样回收率为95.8%，说明HPLC法比较准确和可信。

图5 HPLC法测CGA标准曲线

表2 HPLC法CGA回收率表

2.5 拟合曲线的建立

为了找到HPLC法和UV法测定结果之间的关系，采用了线形拟合、指数拟合和多项式拟合的方法，线性拟合见图6，拟合方程为：Y=0.9738X-3.8567，R2=0.9849，其中X轴为UV测定结果，Y轴为HPLC测定结果。指数拟合见图7，其拟合方程为Y=y0+Ae-x/t，y0=-2.01327E7，A=2.01327E7，t= -2.06734E7，R2=0.98357。多项式拟合见图8，其方程为Y=A+BX+CX2+DX3，A=1.386，B=0.4082，C=0.0132，D=-8.434，R2=0.9856。从上述拟合结果可以看出，HPLC法和UV法所测得结果存在差异，并且在一定的范围内，UV所测得结果要大于HPLC所测得的结果，其主要原因是在UV测量的过程中，除了绿原酸以外，其他的酚类物质在327nm处也有吸收，从而为UV测定带来了误差，为了提高UV测定法的准确性，采用Origin8.0对这两种方法进行拟合，结果表明多项式拟合的相关系数（R2=0.9856）略高于线性拟合（R2=0.9849）以及指数拟合（R2= 0.98357），由此选 Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3为最佳拟合方程。

图6 线性拟合图

2.6 拟合方程的验证

在以CGA标准品为检测样品建立了拟合方程后，利用UV法对醇提液中的CGA进行测定，经拟合方程校正CGA的含量，并通过HPLC对计算结果进行验证，结果表明在一定的浓度范围内（5.5～33μg/mL），样品经拟合方程校正的浓度值与HPLC法所测得的结果相近，t检验的结果表明，在0.05水平下，两组数据之间没有显著差异（p=0.6722）。

图7 指数拟合图

图8 三次多项式拟合图

紫外分光光度法是一般常规实验室常采用的检测方法。但是提取液中成分复杂多样，存在各种杂质的干扰，造成测定结果误差很大。高效液相色谱法以其高速、高效、高灵敏度等优点在检测应用中逐渐增多，但缺点是利用HPLC检测需要时间较长，并且成本较高。国内一些学者虽然对紫外可见分光光度法和高效液相色谱法对绿原酸的含量的测定有过研究和比较［9］，但是却没有对UV测定进行校正，本研究给出UV法测定CGA含量的拟合方程，方程表明，在一定浓度范围内（5.5～33μg/mL），该方程准确可靠，从而可以实现UV法快速、准确地测量大批量样品中的CGA含量。在实际操作中，建议将CGA浓度控制在推荐的范围内，如果浓度过低或过高，需要适当地浓缩或稀释，以确保实验结果的准确性。

表3 多项式拟合结果验证

3 结论

3.1 建立了CGA的UV检测方法，当CGA浓度在0.01～0.03mg/mL时有良好的线性关系，并求得线性回归方程为Y=0.0169X+0.0002，R2=0.9952。

3.1 建立了 CGA的 HPLC检测方法，CGA在2～80μg/mL的浓度范围内是线性相关的，线性方程为Y=0.09946+0.22857X，R=0.99984，方程显著性水平是0.0001。

3.3 在线性、指数、三次多项式曲线拟合的方法中，多项式拟合Y=1.386+0.4082X+0.0132X2-8.438X3为最佳拟合方程，其中Y为HPLC测定值，X为UV测定值，R2=0.9856。并且在5.5～33μg/mL浓度范围内，样品经拟合方程换算成的浓度与HPLC测定结果相近，并在0.05水平下，两组数据之间没有显著差异（p=0.6722）。

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Study on chlorogenic acid determination method from sunflower seed meal

HU Xian-bao1，2，LV Jia-ping1，*，LIU Lu1，FAN Gui-sheng2，ZHANG Shu-wen1，YAN Kun1，XIE Yue-jie1
（1.Institute of Agro-food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China；2.Food Science and Engineering Department，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China）

ln order to create a kind of quickly，effective and precise chlorogenic acid（CGA）determination method，on the basis of HPLC and UV methods，Origin8.0-statistical analysis software was adopted to build a fitted equation with HPLC results as Y value，and with UV result as X value.The equation was obtained as：Y=1.386+ 0.4082X+0.0132X2-8.438X3，R2=0.9856.According to confirmatory test results，in the 5.5～33μg/mL concentration range，the fitted equation was precise and reliable.And so the modified UV method can determine CGA quickly，precisely and with large quantities.

chlorogenic acid；UV method；HPLC method；determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0341-04

2010-03-09 *通讯联系人

胡鲜宝（1984-），男，硕士研究生，研究方向：农产品加工。

中国农业科学院作物科学研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资助项目。