黄参粗多糖脱蛋白工艺以及对亚硝酸盐清除作用的研究

郭小鹏，田呈瑞，*，高春燕，孟友武

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；2.甘肃省山丹军马场食品公司，甘肃张掖734104）

黄参粗多糖脱蛋白工艺以及对亚硝酸盐清除作用的研究

郭小鹏1，田呈瑞1，*，高春燕1，孟友武2

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安710062；2.甘肃省山丹军马场食品公司，甘肃张掖734104）

采用Sevag法、TCA-Sevag法、木瓜蛋白酶-Sevag法对黄参粗多糖脱蛋白工艺进行了研究。另外，研究了体外模拟胃液条件下黄参多糖对亚硝酸盐的清除作用，采用分光光度法测定了黄参粗多糖对亚硝酸盐的清除率。实验结果表明，通过比较三种脱蛋白方法，木瓜蛋白酶-Sevag法较好，累计蛋白去除率可达68.65%，累计多糖损失率17.14%。黄参多糖对亚硝酸盐清除最佳方法为：向25mL模拟胃液中加入50mg黄参多糖，反应时间为15min，对亚硝酸盐的清除率最高，可达86.6%。

黄参，脱蛋白，亚硝酸盐，清除

黄参是伞形科迷果芹属的迷果芹（Sphallerocarpus gracilis）的肉质直根，主要分布于大黄山、祁连山草原地带，海拔高度2400～2900m。黄参是山丹县高寒阴湿地区生长的一种二年生野生草本植物，其肉质直根富含人体必需的多种氨基酸、矿物质和微量元素，是一种纯天然保健食品［1-2］。黄参具有很高的营养价值和药用价值，是一种理想的保健食品，且具有祛风、胜湿、止痛等功效，对治疗晚期癌、诱导癌细胞调节作用显著［3］。目前黄参多糖的提取多采用水提醇沉的方法，得到的粗多糖中含有大量的杂质如蛋白质、鞣质、色素等。黄参蛋白质含量较高，所提多糖中蛋白质含量也较高，分离纯化多糖过程中，脱蛋白是非常关键的一步，目前常用去除蛋白质类成分的主要方法有Sevag法、TCA-Sevag和木瓜蛋白酶-Sevag法。本文采用上述三种方法脱除黄参多糖中的游离蛋白，通过测定前后蛋白质成分和多糖含量的变化，比较三种脱蛋白方法的优缺点，以确定黄参多糖脱蛋白最佳工艺，为黄参多糖的分离纯化提供理论基础。同时在体外模拟胃液条件下，研究黄参多糖清除亚硝酸盐的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黄参 2009年10月15日采自甘肃山丹军马场；考马斯亮蓝G25、牛血清蛋白、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、石油醚、无水乙醇、盐酸、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、亚硝酸钠 均为分析纯；模拟胃液［4］称取2.0g NaCl，加双蒸水溶解，移入1000mL容量瓶，加入7mL浓盐酸，双蒸水定容至刻度。

TU-1800/1800S型紫外可见分光光度计 北京谱析通用仪器厂；722型分光光度计 上海市精密科技仪器有限公司；LG微波炉、LXJ-IIB型离心机、RE-52旋转式蒸发器 上海安亭实验仪器有限公司；高速粉碎机 浙江省上虞市大亨桥化验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 黄参粗多糖的提取工艺 黄参粉（60℃干燥，过20目筛）→脱脂（石油醚，2h）→水溶胀→微波提取→离心（4000r/min）→取上清液→3倍 95%乙醇醇沉→离心（4000r/min）→取沉淀→真空干燥→黄参粗多糖

1.2.2 葡萄糖标准曲线的制作和蛋白质标准曲线的制作 葡萄糖标准曲线制作参考文献［5］，蛋白质标准曲线制作参考文献［6］。

1.2.3 操作要点

1.2.3.1 黄参粗多糖脱蛋白工艺研究 Sevag法：取10mL已知浓度的粗多糖溶液，将提取液与有机溶剂（氯仿与正丁醇体积比5∶1混合，用振荡器剧烈振荡20min，4000r/min离心20min，除去沉淀。从除去蛋白质的多糖溶液中，取出1mL进行考马斯亮蓝法测蛋白质含量，再取出5mL加入50mL容量瓶中定容，然后用苯酚硫酸法测出多糖含量。使用标准曲线计算其累计蛋白质去除率及累计多糖损失率。

TCA-Sevag法：先在一定浓度多糖溶液中加入一定体积三氯乙酸，使其终浓度为4%，混匀后于4℃冰箱静置过夜，次日4500r/min离心20min，取上清液，再采用上述Sevag法脱蛋白，计算其累计蛋白质去除率及累计多糖损失率。

木瓜蛋白酶-Sevag法：加入0.1%的木瓜蛋白酶（w/v）在pH6.4条件下，于60℃酶解3.5h，再采用上述Sevag法脱蛋白，计算其累计蛋白质去除率及累计多糖损失率。

1.2.3.2 黄参多糖对亚硝酸盐清除作用的研究 各称取一定质量的黄参多糖放于50mL容量瓶中，加入25mL模拟胃液，用超声增溶，37℃预热10min，加入5μg/mL的亚硝酸钠溶液2mL，然后把混合物置于37℃水浴锅中避光反应一定时间；加入0.4%对氨基苯磺酸2mL，摇匀静置5min；再加入0.2%盐酸萘基乙二胺显色剂1mL，摇匀加水定容，静置15min后以蒸馏水作空白测各溶液的吸光度，计算黄参多糖对NO-2的清除率。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线

由1.2.2方法可得，y=6.8232x+0.0083，R2= 0.9982，其中：y为吸光值，x为葡萄糖量。

2.2 蛋白质标准曲线

由1.2.2方法可得，y=0.0065x+0.0675，R2= 0.999，其中：y为吸光值，x为蛋白质量。

2.3 最大吸收波长的确定

吸取5.0μg/mL NaNO2标准溶液1mL置于10mL具塞试管中，加入2mL 0.4%对氨基苯磺酸，摇匀，放置5min，加入1mL 0.2%盐酸萘乙二胺显色，放置15min，于1cm比色杯中，另以蒸馏水代替亚硝酸钠，用同样方法配制的溶液作为空白，作光谱扫描，测定最大吸收波长为548nm处。

2.4 Sevag法［7］脱蛋白分析

Sevag法脱蛋白，计算其累计蛋白质去除率及累计多糖损失率，见表1。

表1 Sevag法洗脱蛋白前后蛋白质及多糖的变化

2.5 TCA-Sevag法［8］脱蛋白分析

TCA-Sevag法脱蛋白，计算其累计蛋白质去除率及多糖损失率，见表2。

表2 TCA-Sevag法洗脱蛋白前后蛋白质及多糖的变化

2.6 木瓜蛋白酶-Sevag法［9］脱蛋白分析

木瓜蛋白酶-Sevag法脱蛋白，计算其累计蛋白质去除率及多糖损失率，见表3。

表3 木瓜蛋白酶-Sevag法洗脱蛋白前后蛋白质及多糖的变化

2.7 黄参多糖对亚硝酸盐清除率的影响

2.7.1 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响 向25mL模拟胃液体系中加入5.0mg黄参多糖，按1.2.3.2操作，分别反应不同的时间，计算清除率，反应时间对亚硝酸盐清除率的影响，见表4。

由表4可知，当反应在15min最佳清除率时间达到最大。

2.7.2 黄参粗多糖用量对亚硝酸盐清除率的影响向25mL模拟胃液体系中加入不同量的黄参多糖，反应15min，按1.2.3.2操作，计算清除率，黄参粗多糖用量对亚硝酸盐清除率的影响，见表5。

由表5可知，当反应时间为15min，黄参多糖用量为50mg时，亚硝酸盐的清除率最高，可达86.6%。

3 讨论

3.1 实验表明用Sevag法脱蛋白6次后，蛋白质的含量已经变化不大，Sevag法处理6次后，蛋白质总去除率仅为35.63%，多糖损失率为74.62%，多糖损失率较高，可能由于多糖中的蛋白大多数以糖蛋白的形式结合，导致脱蛋白的同时，多糖大量的损失，而且脱蛋白效果极不理想，操作繁琐，重复次数较多，能耗和时耗都很高。用TCA-Sevag法脱蛋白，经TCA处理后蛋白脱除率达到85.44%，多糖损失率为54.12%，可见脱蛋白效果较理想，但是多糖损失率也较高。用木瓜蛋白酶-Sevag法脱蛋白时，木瓜蛋白酶处理后，再经过3次Sevag法处理后，蛋白质的脱除率达到68.65%，多糖损失率仅为17.14%，多糖损失较少，酶将糖蛋白水解分离，故在Sevag处理时，多糖损失较少。使用木瓜蛋白酶-Sevag法脱蛋白，其蛋白脱除率比单独用Sevag法高33.02%，虽然没有TCA-Sevag法脱蛋白高，但是多糖损失率比TCASevag低36.98%，故采用木瓜蛋白酶-Sevag法脱蛋白效果较优。

3.2 据报道，黄酮类、多糖、色素都具有清除亚硝酸盐的作用［10］。本实验表明，在体外模拟胃液实验中，黄参多糖对亚硝酸盐有清除作用，其最佳方法为：25mL模拟胃液加入黄参多糖50mg，反应时间为15min，黄参多糖对亚硝酸盐的清除率最高，可达86.6%。

表4 反应时间对亚硝酸盐清除率的影响

表5 黄参粗多糖用量对亚硝酸盐清除率的影响

［1］张定君，邹卿，唐谦.黄参的生物学特性与栽培技术研究初报［J］.甘肃农业科技，2000（7）：44-45.

［2］陈叶，陈天仁，罗光宏.黄参营养价值及加工工艺技术研究［J］.食品科技，2003（11）：96-100.

［3］许岸高，刘集鸿.黄参冲剂联合化疗治疗晚期胃癌［J］.广东医学，1999，20（2）：150-151.

［4］Board of Trustees.The united states pharmacopeia［M］.1995：2053.

［5］倪受东，严德江，徐先祥.大黄多糖的提取及含量测［J］.中国药业，2007，16（13）：10-11.

［6］夏泉，刘钢，葛朝亮，等.Sevag法去除黄芪粗多糖中蛋白质成分的研究［J］.安徽医药，2007，11（12）：1069-1070.

［7］章银良，李红旗，高峻，等.螺旋藻多糖提取新工艺的研究［J］.食品与发酵工业，1999，25（2）：15-17.

［8］王健.三七多糖的分离纯化及免疫活性的研究［D］.杭州：浙江大学，2001.

［9］刘成梅，万茵，涂宗财，等.百合多糖脱蛋白方法的研究［J］.食品科学，2002，23（1）：89-90.

［10］马鹏飞，马林，孙君社，等.减少肉制品中亚硝酸盐危害的研究进展［J］.食品科学，2005，26（增刊）：170-172.

Study on removal process of proteins from crude Sphallerocarpus gracilis polysaccharides and its scavenging capability to nitrite

GUO Xiao-peng1，TIAN Cheng-rui1，*，GAO Chun-yan1，MENG You-wu2
（1.College of Food Engineering and Nutrition Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Food Limited Liability Company of Shandan Jun Ma Chang，Zhangye 734104，China）

Sevag method，TCA-Sevag and Papain-Sevag method of removing protein process from crude S.gracilis polysaccharides were studied.ln addition，under the condition of simulated gastric juice in vitro，the effect of S.gracilis polysaccharide to scavenge nitrite was studied，using spectrophotometric to determine the parameters of the S.gracilis polysaccharide on clearance rate of nitrite.Experimental results showed that the method of removal of protein by comparing the three kinds of excellent，Papain-Sevag method was better，the accumulated protein in the removal rate was up to 68.65%，the cumulative loss rate of polysaccharide was 17.14%.S.gracilis polysaccharide on the best method for scavenging nitrite：adding 50mg S.gracilis polysaccharide to the 25mL simulated gastric juice，reaction time was 15min，the scavenging rate reached the maximum 86.6%.

Sphallerocarpus gracili；deproteinized；nitrite；scavenging

TS201.2+3

B

1002-0306（2011）02-0274-03

2010-03-31 *通讯联系人

郭小鹏（1986-），男，硕士研究生，从事食品新资源开发研究。