纤维素酶法水解大豆异黄酮糖苷研究

钱丽丽 左 锋 张永忠

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319)(东北农业大学理学院 国家教育部大豆生物学重点实验室2，哈尔滨 150030)

纤维素酶法水解大豆异黄酮糖苷研究

钱丽丽1左 锋1张永忠2

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319)(东北农业大学理学院 国家教育部大豆生物学重点实验室2，哈尔滨 150030)

为了提高大豆异黄酮的生物活性作用，获得更多的大豆异黄酮苷元成分，对纤维素酶水解大豆异黄酮进行了研究，通过单因素试验和正交试验，酶水解的影响因素主要为水解温度、水解时间、酶－底物质量比和酶水解pH值。得到纤维素酶制备大豆异黄酮苷元的较优工艺条件:纤维素酶水解时间17 h，水解温度48．5℃，水解pH值5．0，酶－底物质量比为1．05%。通过小试试验，以脱脂豆粕原料进行提取大豆异黄酮，纤维素酶水解得到苷元产品收率为0．1%，总苷元质量分数为30．79%;以30%大豆异黄酮粉为原料进行水解，获得产品收率为10．2%，总苷元质量分数为47．81%。

纤维素酶 染料木黄酮 黄豆苷元

近年来，流行病理学与动物临床医学研究表明大豆异黄酮苷元(主要是染料木黄酮和黄豆苷元［1］)具有弱雌激素活性、抗氧化活性、抗溶血活性和抗真菌活性，能有效地预防和抑制白血病、骨质疏松、胃癌、乳腺癌和前列腺癌等多种疾病的发生，尤其是对乳腺癌和前列腺癌有积极的预防和治疗作用［2］。对大豆异黄酮进一步深入研究还表明，大豆异黄酮对清除体内自由基［3］、延缓机体衰老、预防和治疗由紫外线照射引起的皮肤老化和各种皮肤癌也具有很好的疗效［4］。大豆中的大豆异黄酮主要以糖苷形式存在，大豆异黄酮苷元含量甚少，仅占总异黄酮质量的2%～3%，目前近5年国内工艺研究主要集中在获得更多苷元形式的大豆异黄酮的加工技术上，由糖苷型到苷元型大豆异黄酮的转化方式有酸水解法、碱水解法、Smith降解和酶法，最为可行的是酶法水解制备大豆异黄酮苷元，研究较多用β－葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷键。孙艳梅等［5］自制了大豆β－葡萄糖苷酶经纯化后水解大豆异黄酮糖苷效果较好。许晶［6］采用里氏木霉β－葡萄糖苷酶在反应温度50℃、水解时间90 min、pH 4．5、加酶量20 U 的条件下水解染料木黄酮水解率为99%。对其他酶的研究还未见报道。试验采用工业化用酶纤维素酶对水解大豆异黄酮的条件进行探索，根据纤维素酶水解糖苷键的原理，通过单因素试验和正交试验酶法水解获得最佳水解工艺。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器设备

黄豆苷(Daidzin简写D)、黄豆苷元(Daidzein简写为De)、染料木苷(Genistin简写为G)、染料木黄酮(Genistein简写为Ge):Sigma公司。纤维素酶:诺奥科技发展有限公司(经测定酶活力38 000 U/mg)。豆粕(东农32):东北农业大学赠送。30%大豆异黄酮粉:哈高科。试验所用甲醇为色谱级，其余试剂为分析纯。

CX－500型超声波清洗机:北京医疗设备二厂;LG10－2．4A型高速离心机:北京医用离心机厂;H．H．S 21－2R型电热恒温水浴锅:上海医疗器械五厂;ZFQ85A型旋转蒸发器:上海医械专机厂;P680戴安高效液相色谱仪:美国戴安公司。

1．2 方法

1．2．1 大豆异黄酮含量测定

高效液相分析条件:

流动相:甲醇∶0．5%乙酸 =40∶60，色谱柱:Nova－Pak C18(3．9 ×150 mm)，柱温:50℃，流速:1．0 mL/min，检测波长:254 nm，进样量:10 μL。

根据标准品染料木黄酮、黄豆苷元、染料木苷和黄豆苷各自性质不同，经紫外检测器测定，样品与标准品比较，以保留时间定性、峰面积定量、外标法计算。

纤维素酶水解制得大豆异黄酮苷元得率的测定:

大豆异黄酮苷元得率=水解前后大豆异黄酮苷元含量差/水解后大豆异黄酮总含量×100%

1．2．2 大豆异黄酮提取液的制备

试验采用脱脂豆粕作为原料，称量脱脂豆粕(过40目筛)1．0 g，80%乙醇浸提剂10 mL，60 ℃水浴振荡3 h，调等电点 pH 4．5，3 000 r/min 离心10 min，上清液为大豆异黄酮提取液。

1．2．3 纤维素酶水解糖苷型大豆异黄酮为苷元型大豆异黄酮的工艺路线

用纤维素酶在适合条件下进行大豆异黄酮酶水解的研究，以酶水解后大豆异黄酮苷元含量增加为指标判定酶的选择依据，纤维素酶水解工艺如下:

大豆异黄酮提取液→旋转蒸发仪蒸去乙醇→加入醋酸盐缓冲液→纤维素酶解→酶灭活→冷却→乙酸乙酯萃取→旋转蒸发仪蒸去乙酸乙酯→丙酮溶解→离心→上清液→蒸去丙酮→乙醇溶解定容→膜过滤→HPLC测定大豆异黄酮各组分含量。

以下试验均进行3次重复，结果以平均值进行计算。

1．2．4 纤维素酶单因素试验

1．2．4．1 时间对酶水解得率的影响

取1．0 g脱脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振荡提取3 h，2次提取，离心后合并滤液，旋转蒸发除去乙醇，醋酸－醋酸钠溶液调pH至5．0的缓冲液100 mL，加酶－底物质量比为1．0%，同时做空白样(即不加酶只加底物看豆粕自身水解情况)，在50 ℃下分别水浴振荡水解4、8、12、16、20 h 经 HPLC检测以苷元水解得率为指标，确定最佳水解时间。

1．2．4．2 温度对酶水解得率的影响

取1．0 g脱脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振荡提取3 h，2次提取，离心后合并滤液，旋转蒸发除去乙醇，醋酸－醋酸钠溶液调pH至5．0缓冲液100 mL，加酶－底物质量比为1．0%。分别在45、50、55、60℃下水浴振荡水解8 h。经HPLC检测以苷元水解得率为指标，确定最佳水解温度。

1．2．4．3 pH 对酶水解得率的影响

取1．0 g脱脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振荡提取3 h，2次提取，离心后合并滤液，旋转蒸发除去乙醇，分别用醋酸－醋酸钠溶液调pH至4．0、4．5、5．0 和 5．5 缓冲液各 100 mL，加酶 － 底物质量比为1．0%，在50℃下水浴振荡水解8 h。经HPLC检测以苷元水解得率为指标，确定最佳水解pH。

1．2．4．4 不同酶－底物质量比对酶水解得率的影响

取1．0 g脱脂豆粕加入15 mL 80%乙醇60℃下水浴振荡提取3 h，2次提取，离心后合并滤液，旋转蒸发除去乙醇，醋酸－醋酸钠溶液调pH至5．0缓冲液100 mL，分别加酶－底物质量比为0．6%、0．8%、1．0%、1．2%、1．4%，同时做空白样(即不加酶只加底物看豆粕自身水解情况)，分别在50℃下水浴振荡水解8 h。经HPLC检测以苷元水解得率为指标，确定最佳酶－底物质量比。

1．2．5 纤维素酶正交试验确定酶水解条件

表1 正交试验因素水平表

2 结果与分析

2．1 纤维素酶单因素试验

2．1．1 不同酶－底物质量比对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

由图1可知，随着添加纤维素酶－底物质量比不断增加，苷元水解得率也不断迅速增加，当增加到1．0%时大豆异黄酮苷元水解得率较高。

图1 纤维素酶酶－底物质量比对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

2．1．2 时间对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

由图2可知，纤维素酶水解时间随着时间的延长，苷元水解得率增加，达到一定时间以后，水解得率上升缓慢，纤维素酶水解时间为16 h时有较优水解得率。

图2 纤维素酶水解时间对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

2．1．3 pH对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

由图3可以看出，pH对酶活力影响较大，不同的pH环境内，大豆异黄酮苷元水解程度有很大差异，当pH为4．0时，大豆异黄酮苷元水解得率只有20%，而当pH为5．0时大豆异黄酮苷元水解得率增加一倍，其总水解苷元得率可达到近45%。

图3 pH对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

2．1．4 温度对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

由图4可以看出，温度对纤维素酶水解得率影响较前面几个因素较小，当温度在50℃时有较高苷元水解得率。

图4 温度对大豆异黄酮苷元水解得率的影响

2．2 纤维素酶正交试验

由表2可以看出影响纤维素酶水解效率的主次因素依次为B＞A＞D＞C。表明温度和水解时间是影响糖苷型大豆异黄酮水解的主要因素，而酶－底物质量比和pH是次要因素。最佳水解条件为A3B1C2D3，即纤维素酶水解时间17 h，水解温度48．5℃，水解pH 5．0，酶 －底物质量比为1．05%。

表2 正交试验方案及结果

2．3 纤维素酶水解制备富含苷元大豆异黄酮粉

利用上述较优条件进行富含苷元的大豆异黄酮粉，采用豆粕和30%含量的大豆异黄酮粉为原料，进行纤维素酶水解，多次萃取，回收溶剂干燥后得到富含苷元的大豆异黄酮。经HPLC检测苷元含量及收率见下表3。水解前后样品色谱图见图5、图6。

表3 纤维素酶法制备大豆异黄酮苷元

由表3可计算出5 g含量30%的大豆异黄酮经纤维素酶水解后可得到黄豆苷元177 mg，染料木黄酮67 mg;10 g脱脂豆粕经纤维素酶水解可得到黄豆苷元 1．07 mg，染料木黄酮 3．9mg。

由图5、图6可见，由峰出现的先后顺序检测物质依次为:溶剂峰、黄豆苷D(5 min)、染料木苷G(8 min)、丙二酰基黄豆苷MD(15 min)、丙二酰基染料木苷MG(25 min)、黄豆苷元De(23 min)、染料木黄酮Ge(40 min)，水解后黄豆苷元De和染料木黄酮Ge峰明显增加，黄豆苷和染料木苷峰明显减小，说明纤维素酶水解糖苷键效果明显。

3 结论

试验是通过寻找工业化酶制备富含苷元的大豆异黄酮中，初步确认纤维素酶能够水解制备大豆异黄酮苷元，通过单因素试验和正交试验得出采用纤维素酶水解糖苷形式大豆异黄酮为苷元形式大豆异黄酮较优条件为:水解时间17 h，水解温度48．5℃，水解pH 5．0，酶－底物质量比为1．05%。通过以脱脂豆粕原料进行提取大豆异黄酮，纤维素酶水解得到苷元产品收率为 0．1%，总苷元质量分数为30．79%;30%大豆异黄酮粉获得产品收率为10．2%，总苷元质量分数为47．81%。

［1］张永忠，孙艳梅．大豆异黄酮研究中的名词术语［J］．中国粮油学报，2004，(4):46 －49

［2］Kritz Silverstein D，Goodman Gruen D L．Usual dietary isoflavone intake，bone mineral density，and bone metabolism in Postmenopausal Women［J］．Womens Health Gend．Based Med．2002，11(1):69 －78

［3］Ghosh P，Fenner G P．Improved method for gas chromatographic analysis of genistein and daidzein from soybean(glycine max)seeds［J］．Agric．Food Chem，1999，47(9):3455 －3456

［4］Wang G，Kuan S．A simplified HPLC method for the determination of phytoestrogens in soybean and its processed products［J］．Agric．Food Chem．，1990，38:185 －190

［5］孙艳梅，张永忠．大豆β－葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的研究［J］．中国粮油学报，2006，21(2):86－89

［6］许晶，孙艳梅．里氏木霉β－葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮糖苷的工艺研究［J］．中国粮油学报，2009，24(3):31 －34．

Hydrolysis of Soybean Isoflavone Glucosides by Cellulase

Qian Lili1Zuo Feng1Zhang Yongzhong2

(College of Food Science，August－ first Land Reclaim University1，Daqing 163319)
(College of Science，ScienceNortheast AgricultureUniversity，Key Laboratory of Soybean Biology of National Ministry of Education2，Harbin 150030)

For increasing the biological activity of soybean isoflavones and producing aglycon from soybean isoflavones，soybean isoflavones hydrolysis by cellulase was studied．The single factor experiment and orthogonal experiment revealed that the affecting factors during the enzymatic hydrolysis of soybean isoflavones were hydrolysis temperature，time，enzyme dosage and pH，and the following best conditions of the enzymatic hydrolysis were obtained:enzymatic hydrolysis time 17 h，temperature 48．5 ℃，pH 5．0，and enzyme dosage 1．05%．Taking isoflavones extracted from defatted soybean meal as raw material to be hydrolyzed by cellulase，the yield of aglycon was 0．1%，the total aglycon content of product was 30．79%．Taking 30%isoflavones meal as material，the aglycon yield was 10．2%，and product aglycon content was 47．81%．

cellulase，genistein，aglycon

TS218

A

1003－0174(2011)03－0016－04

黑龙江省“十一五”重大科技攻关专项大豆综合加工关键技术研究与开发(GA06B402－4)

2010－02－26

钱丽丽，女，1979年出生，讲师，天然保健功能因子开发

张永忠，男，1953年出生，教授，研究生导师，食品化学