葵花籽分离蛋白不同酶解产物清除自由基活性的研究

王海凤 王常青 吕 鹏 刘佳璐 许 洁 赵陈勇

(山西大学生命科学学院1，太原 030006)

(山西大学化学化工学院2，太原 030006)

葵花籽分离蛋白不同酶解产物清除自由基活性的研究

王海凤1王常青1吕 鹏1刘佳璐2许 洁1赵陈勇1

(山西大学生命科学学院1，太原 030006)

(山西大学化学化工学院2，太原 030006)

分别采用Alcalase酶与酸性蛋白酶、Alcalase酶与胃蛋白酶两种组合方式酶解葵花籽分离蛋白，依次得到多肽A和多肽B两组酶解产物。研究表明:这两组酶解产物对·OH、O2·－和DPPH·自由基的清除作用均明显高于葵花籽分离蛋白(P＜0．05);与谷胱甘肽(GSH)相比，多肽A在一定范围内清除·OH和O2·－的效果显著高于GSH(P＜0．05)，清除DPPH·的效果低于GSH;而多肽B清除O2·－和DPPH·的效果不及GSH。电泳技术和凝胶层析分析发现，多肽A、B两组酶解产物的相对分子质量分布有所不同，尽管这两种多肽的分子质量大部分都小于3 000 u，但是多肽A中小于1 000 u的多肽比例大于多肽B，达到62．44%。

葵花籽多肽 自由基 分子质量分布

人体新陈代谢产生的自由基过量会导致心血管疾病、脑神经损伤、衰老等诸多疾病。因此，寻找一种高效、低毒的自由基清除剂，用于降低体内自由基水平、延缓衰老、防治疾病，已成为目前研究的热点。随着对小分子功能肽的深入研究，人们已成功地从玉米、蛋清和海洋动物［1］等动植物蛋白资源中酶解得到具有清除自由基作用的活性肽，葵花籽作为一种重要的油料作物，其榨油后剩余的饼粕中也含有丰富的蛋白质，但是国内外对于葵花籽蛋白酶解产物多肽的研究报道相对较少。我国葵花资源丰富，开发葵花籽多肽的成本低，应用前景良好。本文研究葵花籽分离蛋白在不同酶解工艺条件下水解得到两组酶解产物，分析各自的分子质量分布范围，并以谷胱甘肽和葵花籽分离蛋白为对照，研究了两组产物对清除自由基的效果，以及抗氧化活性机理与分子质量的关系，为将其开发成功能性食品基料提供试验依据。

1 材料和方法

1．1 试验材料

葵花籽分离蛋白:自制;牛血清蛋白、卵清蛋白、核糖核酸酶A、维生素B12、抑肽酶:美国sigma公司;Alcalase酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶:天津大茂化学试剂厂;超低分子质量蛋白(Marker 3．4～20．1 ku):上海升正生物技术有限公司;谷胱甘肽(GSH):上海锐聪科技发展有限公司;其他试剂均为AR级。

1．2 主要仪器

JY－C电泳仪:北京君意东方电用设备有限公司;凝胶色谱系统(HD－003－C紫外检测仪和XWT－1044S台式记录仪):上海天成科技有限公司;WFZ UV－2100型紫外分光光度计:尤尼柯上海仪器有限公司。

1．3 试验方法

1．3．1 多肽A和多肽B的酶解工艺

将葵花籽蛋白溶液在92℃预处理5 min后，分别用不同的两步酶解工艺，制备两组酶解产物，记作多肽A和多肽B(见表1)。多肽A制备:先用Alcalase酶水解5 h，灭酶后加入酸性蛋白酶再水解6 h。多肽B制备:同样先用Alcalase酶水解5 h，灭酶后加入胃蛋白酶再水解6 h。各酶均在各自最佳条件下水解。最终酶解液经沸水灭酶，离心取上清液，测定测定A、B两种水解液中总氮含量(TN)、游离氨基氮的含量(AN)、水解度(DH)和多肽得率，初步分析两种工艺对葵花籽蛋白的酶解效果。

表1 两种不同酶解工艺用酶最佳水解条件

1．3．2 指标测定方法

TN的测定采用半微量凯氏定氮法。AN测定按照GB/T5009．39的甲醛滴定法。多肽含量测定采用三氯乙酸沉淀法［2］。

水解度DH=AN/TN×100%

多肽得率=上清液中多肽含量/样品中的TN×100%

1．3．3 葵花籽多肽A和多肽B分子质量测定

1．3．3．1 Tricine－SDS －PAGE 电泳分析

以标准蛋白的相对分子质量的对数logMr(纵坐标)和相对迁移率Rf(横坐标)作图，得到相对分子质量Mr与迁移率Rf标准曲线的的回归方程logMr=－1．648 9Rf+4．573 1，根据样品的相对迁移率 Rf(蛋白带迁移距离/溴酚蓝迁移距离)，分析计算葵籽多肽的分子质量分布。

1．3．3．2 SephadexG －75 凝胶层析分析

将5种标准蛋白:牛血清蛋白、卵清蛋白、核糖核酸酶A、抑肽酶和VB12分别上样至Superdex 75 10/300 GL 凝胶色谱柱，用含 0．15 mol/L NaC1，pH 7．0的PBS缓冲液洗脱，在280 nm检测，计算得到分子质量对数和出峰体积的回归方程。在同样条件下用回归方程和面积归一法计算样品中不同分子质量的分布。

1．3．4 体外抗氧化活性测定

1．3．4．1 羟自由基(·OH)清除活性的测定［3］

取0．75 mmol/L的邻二氮菲溶液1 mL于10 mL具塞试管中，依次加入2 mL 0．2 mmol/L PBS缓冲液(pH 7．4)、1 mL 0．75 mmol/L FeSO4溶液立即混匀，加入1 mL不同浓度的样品溶液，混匀后加入1 mL 0．01%H2O2，用去离子水定容，37 ℃水浴 60 min，在510 nm处测定其吸光度值。对羟自由基的清除率按下式计算:

清除率 =［(A1－A0)/(A2－A0)］×100%

式中:A1为加入H2O2和样品时的吸光度;A0为加入H2O2但不加样品时吸光度;A2为H2O2与样品都不加时的吸光度。

1．3．4．2超氧阴离子(O－·2)清除活性的测定［4］

用邻苯三酚自氧化法。

超氧自由基清除率=［(V0－V1)/V0］×100%

式中:V0为对照组邻苯三酚的自氧化速率;V1为样品组邻苯三酚的自氧化速率。

1．3．4．3 DPPH 清除活性的测定［5］

取不同浓度的样品溶液 2 mL，加入 2 mL 0．1 mmol/L DPPH溶液混匀，避光反应30 min后，于517 nm处测定吸光度值A1;空白组以代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液。清除率按下式计算:(清除率=［1－(A1－A0/A2］×100%

式中:A1为样品组吸光度，A0为空白组吸光度，A2为对照组吸光度。

1．3．5 统计分析

数据统计均运用SSPS12．0软件进行。

2 结果与讨论

2．1 两种酶解工艺基本指标比较

两种酶解工艺制备的多肽A和多肽B上清液中总氮含量(TN)、游离氨基氮的含量(AN)、水解度(DH)和多肽得率检测结果见表2。由表2可知，多肽A水解度略低于多肽B，而多肽得率却高于多肽B，这可能与酸性蛋白酶和胃蛋白酶的酶切效果有关，酸性蛋白酶酶切位点比较广泛，所以多肽的得率相对较高。但这些指标尚需进一步分析多肽的分子量分布来验证。

表2 两种酶解工艺指标比较

2．2 两种酶解物的分子量分布对比

2．2．1 Tricine－SDS－PAGE 电泳分析

图1 多肽A、B的电泳图谱

由电泳图谱(图1)可见，多肽样品A和B对大分子蛋白和多肽水解效果较好，在10 000 u以上几乎没有条带出现，并且样品在分子质量3 400 u以后呈现的电泳谱带着色较深并连续聚集。说明多肽A与B的分子质量大多数处于3 400 u以下。同时根据样品迁移率Rf计算可知与样品B相比，样品A中含有的分子质量＜1 500 u的小分子肽较多。

2．2．2 Superdex G －75凝胶层析分析

SuperdexG－75凝胶色谱分析得到相对分子质量Mr与洗脱体积Ve的回归方程logMr=－0．180 9Ve+6．561 7，计算得知多肽样品A和B在6 500 u之前几乎没有出现洗脱峰，第一个峰对应的分子质量都在3 000 u左右，小于3 000 u的多肽都在75%以上(见表3)。但是，多肽A在23 mL以后有多个的洗脱峰，而多肽B在此之后没有洗脱峰出现。计算发现，先经碱性蛋白酶、再用酸性酶酶解的多肽A中，小于1 000 u的小分子多肽为62．44%;而先经碱性蛋白酶、再用胃蛋白酶酶解的多肽B中小于1 000 u的小分子多肽为46．4%。可见，多肽A中的小分子肽比多肽B多，与电泳分析结果基本一致。

表3 葵籽多肽A、B分子质量分布/%

2．3 葵花籽多肽A、B清除自由基的效果

2．3．1 清除羟自由基(·OH)的活性比较

羟基自由基是生物体内最具进攻性的活性氧，它可以通过多种方式与生物体内分子作用，由图2、表4可知，在不同浓度下，多肽A和B以及GSH对·OH的清除率均显著强于葵籽分离蛋白(P＜0．05)，清除效果为多肽A＞多肽B＞GSH＞葵籽分离蛋白。在试验浓度下，两种葵籽多肽的清除效果均显著优于GSH(P＜0．05)。

图2 多肽A和B的superdexG－75凝胶色谱

表4 葵籽分离蛋白、葵籽多肽和GSH对羟自由基(·OH)的清除作用(x±s，n=6)

2．3．2 清除超氧阴离子自由基的活性比较

超氧阴离子浓度过高会对蛋白质、DNA等大分子造成损伤［7］。由表5可见，葵籽多肽A和B对O－·2的抑制作用随浓度的增加抑制作用提高。多肽A在低浓度(1～4 mg/mL)时其清除率低于GSH(P＜0．05)，但在高浓度(10 mg/mL)与GSH的清除效果处于同一水平，这可能是在较高浓度下，多肽A中具有清除O－·2的活性多肽之间的交互效应增强所至。多肽B在不同浓度下对O－·2的清除率均低于谷胱甘肽(P＜0．05)。葵花籽分离蛋白在此体系中不溶解，故不能用来做对照组。

表5 多肽A、多肽B和GSH对清除超氧阴离子()的清除作用(x±s，n=6)

表5 多肽A、多肽B和GSH对清除超氧阴离子()的清除作用(x±s，n=6)

注:*表示多肽组与GSH组对照，P＜0．05

质量浓度/mg/mL/%多肽A 多肽B清除率GSH 1 73．21 ±0．12* 55．43 ±0．31*98．72 ±0．02 62．42 ±0．21 4 85．29 ±0．12* 72．82 ±0．12* 90．78 ±0．32 10 96．87 ±0．12 84．62 ±0．15*

2．3．3 清除DPPH自由基的活性比较

样品对DPPH自由基的清除作用反映了其递H+能力［8］。试验表明(见图3)，多肽A和B在不同浓度范围内，对DPPH·的清除作用，均显著强于葵籽分离蛋白(P＜0．05)，且随浓度增加而增强。但从整体趋势看，谷胱甘肽＞多肽A＞多肽B＞分离蛋白。清除DPPH·的作用多肽A强于多肽B这一结果与清除·OH和O－·2)的结果不同，原因可能与清除·OH和O－·2)的反应体系是水溶液，而清除DPPH的反应体系为醇溶液体系有关。

图3 葵籽蛋白、多肽A、多肽B和GSH对DPPH的清除作用

3 结论

用葵花籽分离蛋白为原料，采用Alcalase酶+酸性蛋白酶的水解得到多肽A，采用Alcalase酶+胃蛋白酶的水解得到多肽B。Tricine－SDS－PAGE电泳和Superdex G－75凝胶层析分析结果都表明多肽A与B的分子质量较小，大多数处于3 400 u以下，但是样品A中含有的小于1 500 u小分子肽较样品B多。两组样品的清除自由基的试验发现，在任何条件下，葵花籽多肽清除自由基作用均显著优于葵籽分离蛋白，说明葵花籽蛋白转化为多肽具有实际意义。多肽A和多肽B清除·OH的效果显著高于谷胱甘肽;多肽A在高质量浓度(10 mg/mL)时，清除的效果与GSH的清除率相当，但多肽B不如GSH;两种酶解产物对DPPH的清除率均不如GSH。总体来看多肽A比多肽B清除自由基效果好，更适合开发抗氧化产品。

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Study on Free Radicals Scavenging Activity of Different Hydrolysates from Sunflower Seed Protein

Wang Haifeng1Wang Changqing1Lv Peng1Liu Jialu2Xu Jie1Zhao Chenyong1

(College of Life Science and Technology，Shanxi University1，Taiyuan 030006)
(Department of Chemistry，Shanxi University2，Taiyuan 030006)

Sunflower seed proteins were prepared with two different bienzymatic hydrolysis processes respectively with two compositions of Alcalase and acid protease＆ Alcalase and pepsin，and then two groups of hydrolysates respectively noted the peptides A and B were obtained in turn．The research showed that the free radical scavenging activities on·OH、and DPPH· of peptide A and B were significantly higher than sunflower seed proteins(P＜0．05);compared with glutathione(GSH)，the scavenging effects of peptides A on·OH andwere significantly higher than GSH(P ＜0．05)，but the effects of DPPH scavenging were lower than GSH;while the effects on scavengingand DPPH of peptides B were lower than GSH．The results of electrophoresis and gel chromatography analysis showed that molecular weight distribution of peptides A and B were different，their molecular weight were less than 3 000 u，but the peptide A with low molecule weight less than 1 000 u accounted for the higher proportion than peptide B，of which the proportion reached 62．44%in peptide A．

sunflower seed peptides，free radical，molecule weight distribution

TS201．1

A

1003－0174(2011)03－0056－04

2010－04－19

王海凤，女，1985年出生，硕士，食品科学

王常青，男，1956年出生，教授，硕士生导师，营养与功能食品的开发