湖南省泡状带绦虫线粒体nad1基因的序列测定及分析

伍慧兰

(湖南第一师范学院，湖南长沙410205)

湖南省泡状带绦虫线粒体nad1基因的序列测定及分析

伍慧兰

(湖南第一师范学院，湖南长沙410205)

以从我国湖南长沙和湘西犬小肠中采集的2条泡状带绦虫作为研究对象，用引物JB11及JB12扩增泡状带绦虫的pnad1片段，应用C lustalX 1.81程序对序列进行比对，同时利用DNAstar5.0中的Megalign程序进行同源性分析。结果显示来自湖南长沙和湘西的2条泡状带绦虫的pnad1序列均为391bp。研究结果为泡状带绦虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。

泡状带绦虫；线粒体DNA；nad1基因；序列分析

泡状带绦虫（Taeniahydatigena）寄生于犬、狼和狐狸等动物的小肠内。绦期幼虫（细颈囊尾蚴，Cysticercus tenuicollis）寄生于猪、绵羊、山羊的肝脏浆膜、大网膜、肠系膜、肝、肺等处，对幼龄动物危害极大，偶尔也可感染人[1-2]。因此，正确鉴定泡状带绦虫，对预防和控制该病的发生具有重要意义。线粒体基因组具有结构简单、母系遗传、缺少重组、进化速率快等特点，特别适合作为遗传学研究的标记[3-5]。本研究以采自湖南长沙和湘西地区犬小肠中的泡状带绦虫为研究对象，对其nad1基因的部分序列(pnad1)进行PCR扩增和序列分析，旨在为泡状带绦虫的分类、鉴别诊断以及本病的防治等研究提供依据。

一、材料与方法

（一）材料

1.虫体样品：本研究所用的泡状带绦虫样品采自湖南长沙(CSTY1)和湖南湘西(XXTY1)。

2.主要试剂：Taq酶（大连宝生物公司产品），蛋白酶K（Merck公司产品）。WizardTMDNA Clean-up System（Promega公司产品）、PCR 试剂（Buffer、MgCl2、dNTPs）为大连宝生物公司产品。

3.样品DNA的制备：从70%酒精保存液中取出单个虫体，置于1.5mL Eppendorf管中。按照Promega公司基因组DNA提取试剂盒（Wizard SV Genomic DNA Purification System）的使用说明书提取泡状带绦虫基因组DNA，将提取的基因组DNA置于﹣20℃保存备用。

（二）方法

1.PCR扩增用Bowles[6]等报道的引物JB10和JB11来扩增线粒体pnad1，其序列为：JB11：5'-AGATTCGTAAGGGGCCTAATA-3' 和 JB12：5'-ACCACTAACTAATTCACTTTC-3'。引物由上海生工生物技术有限公司进行合成。反应体系为25μL，其中10×PCR buffer2.5 μL；MgCl2 4 μL；dNTPs（25mM）2 μL；Primer（50 pmol/μL）0.25 μL；Taq polymerase（5 U/μL）0.25 μL；双蒸水 14.75 μL；模板 DNA 1 μL。扩增条件为：94℃预变性5min，然后94℃变性30 s，55℃退火 30 s，2℃延伸 30 s，共 37个循环，最后 72℃后延伸5min。取2μLPCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色，紫外投射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。PCR产物保存备用。

2.测序：将PCR产物送上海生工生物技术有限公司测序，然后进行序列比较和分析。

3.nad1基因序列测定及其在种系发育分析中的应用：将PCR产物送上海生工生物技术有限公司直接测序，测序结果用DNAstar 5.0软件进行分析。从GenBankTM检索现有带科绦虫nad1序列（表1），然后与之进行相似性比对和带科绦虫种系发育分析。利用Clustal X1.81及Mega 4.0软件对获得的CSTY1、XXTY1和GenBankTM的泡状带绦虫nad1基因序列进行比对及计算遗传距离，然后用Phylip 3.67程序中的最大简约法 (Maximum parasimony，MP)绘制种系发育树，以猪蛔虫Ascaris suum（AS）为外群。最大简约法采用Branch and bound模型分析，采用自展检验(bootstrap test)估算所构建系统树的可靠性，复制数均为1000。同时利用DNAstar 5.0中的Megalign程序进行相似性分析。

表1 不同带科绦虫的nai1序列信息

二、结果

（一）PCR扩增结果

2个泡状带绦虫样品均成功地扩增出约450 bp的pnad1，与预期目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性，PCR产物电泳图见图1。

（二）测序结果及分析

2个样品pnad1碱基序列长度相同，均为433bp，剔除引物后，均得到391bp的序列。A+T的含量分别为 72.38﹪(CSTY1)和 72.12﹪(XXTY1)，样品序列与GenBankTM收录的泡状带绦虫成虫的相应序列(pnad1登录号为GQ228819)进行比较，经DNAstar 5.0的MegAlign软件分析显示，两个虫株的pnad1测序结果与该序列变异的序列的变异碱基数皆小于4，湘西分离株的变异率为0.5﹪和长沙分离株的变异率为0.2﹪。进一步对本研究所测泡状带绦虫pnad1序列之间进行分析，发现湘西分离株和长沙分离株泡状带绦虫序列仅侧在存在着1个基因位点变异。中核苷酸序列表现为第148位碱基“A→G”的转变)（见图2），证明泡状带绦虫nad1基因的部分序列pnad1种内高度保守，两地的泡状带绦虫在pnad1序列存在的微小差异可认为是地理差异。

（三）nad1基因序列系统发生树

采用MP法建树方法构建的系统发生树(图3)显示，湖南长沙分离株和湖南湘西分离株具有高度同源性，与GenBankTM中报道的泡状带绦虫位于同一分枝，系统发生树中的Bootstrap值分别在96%以上，2个分离株所属分枝与其他带科所属分支相隔较远。

三、讨论

为了有效诊断、治疗和控制寄生虫病，有必要对寄生虫虫株作精确的鉴定和分类。对寄生虫虫种及其变种的进化史及分类学上关系方面的认识，不仅具有学术上的价值，而且为今后的研究和控制寄生虫病提供重要的资料。与核基因组DNA相比，线粒体具有相对分子量小、结构简单、进化速度快、母性遗传、无组织特异性等特点。线粒体基因间不发生重组，可以反映出母系的进化历史，这样线粒体一个基因就可以代表整个线粒体基因组的变异情况。mtDNA作为一种核外遗传物质，也正是由于mtDNA的这些特点，使之成为研究寄生虫系统进化的一种很好的分子标记[7]。在绦虫的分类鉴定和群体遗传方面，许多学者研究认为，线粒体基因序列是理想的遗传标记[8-9]。

本研究应用PCR技术对采自湖南长沙和湘西地区的泡状带绦虫样品的线粒体DNAnad1基因的部分序列（pnad1）进行了分析，并与GenBank报道的泡状带绦虫成虫的pnad1序列进行了比较。结果发现，来自中国青海省的泡状带绦虫成虫和湖南长沙、湘西地区犬小肠中的泡状带绦虫的pnad1的序列存在3个碱基的差异，而湖南长沙和湘西的2个样品泡状带绦虫的pnad1的序列仅存在1个碱基差异，这种微小差异可以认为是地理差异。采用最大简约法构建的进化树显示出湖南分离株与Taenia hydatigena位于同一分枝高度同源，湖南分离株所属分枝与其他绦虫所属分枝相隔较远。本试验PCR扩增了泡状带绦虫pnad1序列并进行了序列分析，为泡状带绦虫的分子分类学和分子遗传学的进一步研究提供了初步依据。

[1]李繁,梁珠娴.屠宰猪细颈囊尾蚴病的调查与思考[J].中国兽医杂志,2004,(5):47.

[2]马明筠,蔡双双,谭革.猪细颈囊尾蚴病及其预防[J].兽医临床,2001,(8):52.

[3]McManusDP,Bow les J.Moleculargeneticapproachesto parasiteidentification:theirvalueindiagnosticparasitology andsystematics[J].Int JParasitol,1996,26(7):687-704.

[4]Gasser RB and New ton SE.Genomicandgeneticresearch onbursatenematodes:significance,implicationsand prospects[J].Int JParasitol,2000,30(4):509-534.

[5]Blouin MS.Molecularprospectingforcrypticspeciesof nematodes:mitochondrialDNAversusinternaltranscribed spacer[J].Int JParasitol,2002,32(5):527-531.

[6]Gasser RB,Zhu X Q,McManusD P.NADHdehydrogenase subunit1andcytochromecoxidasesubunit1sequences comparedformembersofthegenusTaenia(Cestoda)[J].Int JParasitol,1999,29(12):1965-1970.

[7]Despres L,Imbert EstabletD,CombesC,etal.Isolationand polymorphisminmitochondrialDNAfromSchistosoma mansoni[J].MolBiochem Parasitol,1991,47(1):139-142

[8]Nakao M,Okamoto M,Sakao Y,etal.Aphylogenetichypothesisforthedistributionoftwogenotypesofthepig tapewormTaeniasoliumworldwide[J].Parasitology,2002,124(6):657-662.

[9]Gasser RB,Zhu X Q,WoodsW.GenotypingTaeniatapewormsbysingles-trandconformationpolymorphismof mitochondrialDNA[J].Electrophoresis,1999,20(14):2834-2837.

SequenceMeasurementand AnalysisofMitochondrialNADH Dehydrogenase Subunit1 ofTaeniaHydatigenaCollected from Hunan Province

WU Hui-lan

(Hunan FirstNormalUniversity,Changsha,Hunan 410205)

To analyze them itochondrialNADH dehydrogenase subunit1(nad1)gene ofTaeniahydatigena collected from Hunan province,one should follow the three steps.Firstly,the partialnad1(pnad1)isamplified from eachTaeniahydatigenasample.Thenpnad1sequencesare aligned by using the ClustalX 1.81.Lastly,sequence homology analysis isconducted by using the Megalign program of the software DNAStar version 5.0.The result shows that the length ofpnad1is 391bp.This result has provided a foundation for further studies ofmolecular identification and moleculargeneticsofTaeniahydatigena.

taeniahydatigena；MitochondrialDNA；nad1 gene；sequence analysis

R383.3

A

1674-831X（2011）04-0137-05

2011-04-12

湖南第一师范学院院级课题（XY10N 01)

伍慧兰（1962—），女，湖南郴州人，湖南第一师范学院教师，主要从事生物实验教学工作。

[责任编辑：胡 伟]