南极磷虾酶解液氯化钙法脱氟工艺的研究

李红艳，薛长湖，王灵昭，王玉明，薛 勇

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003)

南极磷虾酶解液氯化钙法脱氟工艺的研究

李红艳，薛长湖，王灵昭，王玉明，薛 勇

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003)

为解决南极磷虾酶解液氟含量过高问题，以脱氟率为指标，利用响应面法对南极磷虾酶解液氯化钙法脱氟工艺进行优化。优化结果表明，在氯化钙添加量1.38%，初始pH9.0，反应温度20℃时，脱氟率达到89.43%。而且，氯化钙法脱氟过程对酶解液氨基氮、总氮的影响都不显著，是一种较为理想的脱氟方法。

南极磷虾，酶解液，响应面法，脱氟，氯化钙

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

南极磷虾胰蛋白酶酶解液 实验室自制［1］;氯化钙、氢氧化钠、硫酸铜、硫酸钾、冰乙酸、柠檬酸钠、高氯酸、氯化钠等 均为分析纯。

PHS-3C精密酸度计 上海雷磁仪器厂;HH-4电热恒温水浴锅 国华企业;GL-G-Ⅱ立式离心机上海安亭科学仪器厂;JB-1A磁力搅拌器 上海精密科学仪器有限公司;PF-1氟选择电极、232甘汞参比电极 上海雷磁精密仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 分析方法 氟含量分析:0.1mol/L高氯酸浸提-氟离子选择电极法;氨基氮含量分析:甲醛滴定法;蛋白质含量分析:微量凯氏定氮法;数据分析: design expert 7.1.3。

1.2.2 脱氟条件的单因素优化

1.2.2.1 氯化钙添加量的单因素实验 向酶解液中分别添加0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%的氯化钙，磁力搅拌混匀，pH不加调整，25℃水浴反应沉降2h，4800r/min离心分离，取上清液回调pH至初始pH，测定脱氟率和氨基氮损失。

1.2.2.2 初始pH的单因素实验 向酶解液中添加适量的氯化钙，磁力搅拌混匀，pH分别调整为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、12.0，25℃水浴反应沉降2h，4800r/min离心分离，取上清液回调pH至初始pH，测定脱氟率和氨基氮损失。

1.2.2.3 沉降时间的单因素实验 向酶解液中添加适量的氯化钙，磁力搅拌混匀，pH不加调整，25℃水浴分别反应沉降0、0.25、0.5、1、2、3、4、5h，4800r/min离心分离，取上清液回调pH至初始pH，测定脱氟率和氨基氮损失。

1.2.2.4 沉降温度的单因素实验 向酶解液中添加适量的氯化钙，磁力搅拌混匀，pH不加调整，分别于4、25、30、35、40、45℃水浴沉降反应1h，4800r/min离心分离，取上清液回调pH至初始pH，测定脱氟率和氨基氮损失。

1.2.3 响应面法优化脱氟条件 在单因素实验的基础上，选择对脱氟率影响较大的氯化钙添加量、初始pH、反应温度三个因素，按照Box-Bohnken设计法每个因素取三个水平，以(-1，0，1)编码进行实验，以脱氟率为响应值，借助design expert7.1.3软件进行数据分析并建立二次响应面经验模型，从而寻找最佳脱氟条件。共有17个实验，其中12个为析因点，5个为零点以估计误差。实验因素水平设计如表1。

表1 因素水平设计表

2 结果与讨论

2.1 氟离子检测标准曲线的绘制

由0.1mol/L高氯酸浸提-氟离子选择电极法，获得氟离子检测的标准曲线方程为y=58.6x-246.16，其中，y为电势值(mV)，x为氟离子浓度的对数［lgC (F-)］，R2为0.9998，在氟浓度0.05～500mol/L范围内线性关系良好。

2.2 单因素实验

2.2.1 氯化钙添加量对脱氟的影响 由图1可以看出，随着氯化钙添加量的增加，酶解液脱氟率逐渐增加，添加量超过1%后，脱氟率随添加量的增幅变缓，这与M.Islam等［6］的研究结果类似。M.Islam认为，这可能是由于添加量大时反应活性位点重叠，有效表面积减小的缘故。实验中还发现，氯化钙添加量过大会使酶解液有酸涩味和苦味，而且，氯化钙作为食品加工助剂，国标［7］中规定一般应在制成最后成品之前除去，有规定食品中残留量的除外。因而添加量并非越大越好，综合考虑我们认为氯化钙添加量1%为宜。

图1 氯化钙添加量与脱氟率的关系

2.2.2 初始pH对脱氟率的影响 由图2可知，随着初始pH的升高，脱氟率呈先上升后稳定不变的趋势，在约pH8.5时首先达到最大脱氟率，其后脱氟率基本保持不变。这与王歆然等［8］的研究结果略有不同，王歆然等的研究表明，氯化钙与原水中的氟反应最佳pH为7.0～9.0，当pH＞10时，氟的去除率大幅降低，认为这与pH高时，Ca2+与OH-形成Ca(OH)2使Ca2+浓度降低有关。但是由本实验结果来看，pH＞10时，脱氟率没有大的变化，推测是由于酶解液中大量的氨基酸小肽等起到缓冲作用的缘故。

图2 初始pH对脱氟率的影响

2.2.3 沉降时间对脱氟率的影响 据文献［9］报道，因为Ca2+和F-生成CaF2的反应速度较慢，且形成的CaF2微细晶粒本身具有一定的溶解度，所以达到平衡时需较长的时间，脱氟反应的沉降时间对脱氟率有显著影响。

由图3可以看出，酶解液的吸附沉降反应非常迅速，在0.5h时已经基本达到平衡，延长沉降时间对提高脱氟率无显著作用(78.4%～80.4%)，这与M.Islam等［6］的研究结果基本相符。因此选定沉降最佳时间为0.5h。

图3 沉降时间对脱氟率的影响

2.2.4 沉降温度对脱氟率的影响 由图4可以看出，脱氟率随温度升高而增大。沉降温度由4℃上升至25℃时，脱氟率显著提高;温度超过30℃后，脱氟率随温度升高变化不大，这一结果与M.Islam等［6］的报道类似。由此推测氯化钙沉脱氟离子脱氟过程是一个吸热过程。

图4 沉降温度对脱氟率的影响

2.3 响应面结果分析

响应面的设计方案及实验结果如表2所示。

表2 Box-Bohnken设计方案及响应值结果

2.3.1 方差分析 方差分析的结果见表3。

表3 方差分析

利用软件对实验结果进行二次多元回归拟合，对表2的数据进行方差分析后，除去不显著项AC得到模型的二次多项回归方程为:

由表3可知，失拟项不显著(P=0.3381＜0.05)，而模型的P值＜0.0001，表明模型高度显著。从表3还可以看出，因素一次项(A、B)、交互项(AB、BC)、二次项(A2、B2、C2)对结果影响是显著的(P＜0.05)，一次项C对结果影响不显著(P＞0.05)。同时，软件分析的复相关系数R的的值为97.75%，表明模型拟合程度良好，实验误差小，可以用于对酶解液氯化钙法脱氟进行分析和预测。

2.3.2 响应曲面图分析 手动优化后，回归方程中的交互项所作的响应面图如图5、图6所示。

图5 氯化钙添加量与初始pH对脱氟率的影响

图6 初始pH与反应温度对脱氟率的影响

由图5、图6可以看出，在所选范围之内，脱氟率随氯化钙添加量的增加和pH的升高而升高，随温度的升高先上升后下降。并且氯化钙添加量与pH的交互作用比较显著，温度的影响不显著，这与表3的结果一致。

2.3.3 验证实验 通过Design Expert7.1.3软件对经手动优化后的回归方程求解，在实验的因素水平范围内预测氯化钙脱氟的最佳条件为:氯化钙添加量1.38%，初始pH为9.0，反应温度20℃，此时的酶解液脱氟率达到89.43%。在此条件下，进行三次验证性实验，测得的脱氟率为87.54%，与理论预测值基本吻合，平均误差为2.11%，说明手动优化后的回归方程对磷虾酶解液氯化钙脱氟的分析和预测都非常可靠。

2.4 脱氟过程中酶解液中氨基氮的变化

单因素实验过程中，对酶解液总氮和氨基氮指标的检测表明，氯化钙法脱氟对酶解液的营养成分影响不显著(总氮损失约5%，氨基氮约3%)。图7是响应面实验中氨基氮损失率与脱氟率的关系图，由图7可见，在氯化钙法脱氟的过程中，氨基氮损失随脱氟率的增加而呈增加趋势，但是损失率仅在3%左右，表明该方法对酶解液的主要营养成分破坏不显著，是比较理想的脱氟方法。

图7 氨基氮损失率与脱氟率的关系

3 结论

通过响应面法优化得到对南极磷虾酶解液氯化钙法脱氟的最佳工艺为:氯化钙添加量1.38%，初始pH9.0，反应温度20℃。经验证，脱氟后酶解液氟含量为 8.3mg/L，实际脱氟率达到理论预测值的97.89%。氯化钙法脱氟过程对酶解液氨基氮、总氮的影响都比较小，是一种较为理想的脱氟方法，对南极磷虾酶解液的进一步开发利用和安全食用有重要意义。

研究中发现，酶解液在氯化钙法脱氟处理后略有苦味涩味，在进一步开发时需要将残存的钙离子除去或通过调味、添加掩蔽剂等掩蔽苦味，这将是今后研究中着重解决的问题。

［1］任艳.南极磷虾蛋白加工利用的初步研究［D］.中国海洋大学，2009.

［2］Meenakshi R C.Maheshwari.Fluoride in drinking water and its removal［J］.Journal of Hazardous Materials，2006，137:456-463.

［3］国家标准局.GB 4809-1984食品中氟允许量标准［S］.北京:中国标准出版社，1984.

［4］陆英，刘仲华.茶叶中氟的研究进展［J］.吉首大学学报:自然科学版，2004，25(4):84-88.

［5］陈后兴，罗仙平，刘立.含氟废水处理研究进展［J］.四川有色金属，2006(1):31-35.

［6］Islam R K.Patel.Evaluation of removal efficiency of fluoride from aqueous solution using quick lime［J］.Journal of Hazardous Materials，2007，143:303-310.

［7］中华人民共和国卫生部中国国家标准化管理委员会.GB 2760-2007食品添加剂使用卫生标准［S］.北京:中国标准出版社，2007.

［8］王歆然，石健，严淑，等.pH对氯化钙除氟效率的影响研究［J］.消费导刊，2008(7):71-72.

［9］刘庆斌.无机含氟废水处理的研究进展［J］.黄石理工学院学报，2009，25(4):7-10.

Study on defluoridation technology of antarctic krill hydrolyzate by adding calcium chloride

LI Hong-yan，XUE Chang-hu，WANG Ling-zhao，WANG Yu-ming，XUE Yong
(College of Food Science and Technology，Ocean University of China，Qingdao 266003，China)

Seeking a solution to the excessive content of fluoride in antarctic krill(Euphausia superba)hydrolyzate，the technology of adding calcium chloride to the hydrolyzate to lower the fluoride content was studied.Taking defluoridation rate as the evaluation index，the condition of defluoridation was optimized through response surface methodology.The results showed that the defluoridation condition was optimal when adding amount of calcium chloride was 1.38%(m/v)，initial pH was 9.0，and reaction temperature was 20℃.Under that condition，the defluoridation rate was 89.43%.Besides，the defluoridation process had insignificant effect on amino nitrogen and total nitrogen content of the hydrolyzate，suggesting that this would be an ideal method of defluoridation.

antarctic krill;hydrolyzate;response surface methodology;defluoridation;calcium chloride

TS254.1

B

1002-0306(2011)03-0330-04

南极磷虾是21世纪人类巨大的蛋白库，其开发利用有着广阔的前景。任艳［1］等对南极磷虾进行酶解获得磷虾蛋白酶解液，蛋白回收率可达到80%以上，是一种较为理想的磷虾蛋白利用方式。但是，磷虾酶解液存在氟含量过高的问题(氟含量达50～60mol/L)。氟是一种具有双阈值性质的微量生命元素，摄入量过高会引起氟斑牙、氟骨病等一系列疾病［2］。GB4809-1984规定了食品中氟允许量的标准［3］，要求鱼类(淡水)氟含量应小于2.0mg/kg，而海产品由于地域差异导致氟含量变化很大，难以规定统一的标准。我国卫生部食品氟允许量制定协作组于1981年规定，每人每天摄取氟的安全限量为3.5mg［4］。为达到安全食用的要求，需要对磷虾酶解液中的氟进行脱除。钙盐沉淀法是化学沉降脱氟的常规处理方法，其原理是Ca2++2F-=CaF2↓。该方法具有简单、处理方便、成本低等优点，在工业处理含氟废水中得到广泛应用［5］。本研究采用氯化钙法对南极磷虾酶解液进行脱氟，并对影响脱氟效果的因素(添加量、温度、pH、反应时间等)进行研究，采用响应面法优化得到最佳脱氟工艺，为进一步探索磷虾酶解液的加工利用，达到安全食用的要求做准备。

2010-03-26

李红艳(1988-)，女，硕士研究生，研究方向:水产品加工与贮藏。