全叶青兰中黄酮类化合物的超声辅助提取工艺研究

全春喜，刘秀颖，刘玉梅，苏景秀

(新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046)

全叶青兰中黄酮类化合物的超声辅助提取工艺研究

全春喜，刘秀颖，刘玉梅*，苏景秀

(新疆大学化学化工学院，新疆乌鲁木齐830046)

通过正交实验和单因素实验优化了全叶青兰总黄酮类化合物的提取工艺，得出最佳提取工艺为:乙醇浓度为70%，料液比为1∶15，提取温度为55℃，总提取时间2h，其中超声辅助提取时间为30min，总黄酮的提取量为25mg/g左右。对该工艺条件下提取所得到的乙醇提取物采用不同极性的溶剂进行极性部位的初步分离后的定性实验结果表明，各提取部位均含有黄酮类化合物，其中乙醚分离的弱极性部分不含邻二酚羟基的黄酮，而乙酸乙酯提取的部分则含有二氢黄酮或二氢黄酮醇类，全叶青兰中的黄酮类化合物以极性较大的黄酮苷类为主，游离苷元的含量较低。

全叶青兰，黄酮类化合物，提取工艺，正交实验

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全叶青兰 采自新疆塔城地区裕民县境内，将全叶青兰粉碎，采用超临界CO2萃取技术分离出其中的脂溶性成分，萃余物备用;芦丁 购自中国药品生物制品检定所;亚硝酸钠、硝酸铝、镁粉、醋酸镁、氯化锶、氢氧化钠、丙酮、乙醚、乙酸丁酯、正丁醇、乙醇等 均购自化学试剂商店，分析纯。

表1 乙醇浓度对总黄酮提取的影响

表2 不同提取方法对总黄酮提取的影响

电子天平 德国赛多利斯BS210S型;WFZ26A型紫外-可见分光光度计 天津光学仪器厂;HH-S4型数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂生产;R-201旋转蒸发仪 上海申科机械研究所;SHB-B95型循环水式多用真空泵，超声仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 总黄酮的测定方法 总黄酮的测定采用硝酸铝比色法［11］。准确称取0.1146g芦丁，用30%乙醇溶解并定容至100mL的容量瓶中，制成1.146mg/mL的芦丁标准溶液待用。分别吸取刚配制好的芦丁标液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL置于8个25mL的容量瓶中，用30%乙醇补至10mL后，加入1mL的5%的NaNO2摇匀，避光保存1h。再加入1mL 10%的Al(NO3)3溶液，摇匀，静置6min，加入10mL的1mol/L的NaOH溶液，摇匀，放置15min后用紫外分光光度计于510nm波长处测定吸光值，得标准曲线为:总黄酮浓度 =-0.03381A510+0.48384，R= 0.9992。样品的测定方法同上，将其中的芦丁标准液用1mL全叶青兰提取液代替，测定结果代入标准曲线求出样品的总黄酮浓度。

1.2.2 黄酮的提取方法 准确称取全叶青兰样品置于三角瓶中，并用相应的提取溶剂提取，控制相应的提取温度、超声时间和提取时间，提取完成后，过滤，滤液定容至一定的体积，测定其中的总黄酮含量。

1.2.3 全叶青兰总黄酮的初步分离 对采用70%乙醇提取的全叶青兰总黄酮的提取物，经浓缩除去大部分乙醇后又依次采用乙醚、乙酸乙酯、正丁醇等不同极性的溶剂对其进行初步分离，分离过程的简单示意图见图1。

图1 全叶青兰中黄酮类化合物的分离

1.2.4 黄酮类的定性分析 浓盐酸-镁粉反应:将样品溶于1.0mL甲醇或乙醇中，加入少许镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1～2min内(必要时微热)即可显色，观测反应现象。铝盐反应:2～3mL样品的甲醇溶液，加2～4mL 1%硝酸铝甲醇溶液，观察并记录反应现象。镁盐反应:在滤纸上滴加一滴供试液，喷以醋酸镁的甲醇溶液，干燥后置紫外光灯下观察。氯化锶反应:取少许样品于小试管中，加入1.0mL甲醇溶解，再加0.01mol/L氯化锶的甲醇溶液3滴和被氨气饱和的甲醇溶液3滴，观察反应现象。

1.3 统计分析

实验数据的统计分析结果均是采用 Microsoft Excel或OriginPro 7.0专业软件来处理的，实验数据表示为平均值±标准偏差(means±standard deviation)。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度的选择

可用于提取黄酮类化合物的溶剂很多，主要为甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮、水或某些极性较大的混合溶剂等，从溶剂的安全性和成本等考虑，本实验选择用乙醇做提取剂。由于黄酮类化合物种类复杂，不同浓度的乙醇对黄酮类化合物的溶解性能不尽相同，因此选择合适的提取全叶青兰的乙醇浓度就很关键。表1是不同浓度乙醇对总黄酮提取的影响。

表1中数据表明，乙醇浓度从30%提高到60%，总黄酮的提取率明显增加，70%乙醇溶液略高于60%，而95%的乙醇提取收率明显下降。因此，在接下来的实验中均采用70%的乙醇作为提取溶剂。

2.2 提取工艺的选择

为了比较不同的实验条件对提取效率的影响，又分别选择了回流、索氏提取、超声波辅助提取等方法，结果见表2。

上述实验数据经t-Test检验的结果表明，在p为0.05的水平下，各方法之间无明显差异，考虑到超声辅助提取所用的时间较少，因此选择超声提取法为宜。

2.3 正交实验对提取条件的选择

影响全叶青兰中总黄酮提取率的因素，溶剂、总提取时间、超声时间、提取温度、料液比等都会对提取效率产生一定的影响。为了更有效地找到提取条件，实验中采用正交实验的方法来优选全叶青兰的提取工艺条件。由前述的乙醇浓度选择实验可知，乙醇浓度在60%～70%之间提取率呈增加趋势，因此在正交实验中进一步选择了乙醇浓度作为一个考察因素，其次，选择以提取温度、提取时间和超声时间作为正交实验的考察因素。表3为正交实验的结果。

由正交实验结果可知，提取温度影响因素最大，其次为超声时间，总提取时间、乙醇浓度。在正交实验选定的温度下，提取温度越高越有利于反应;超声时间为30min有利于提取完全;总提取时间2h对全叶青兰中的黄酮类化合物的提取效率最高，而乙醇浓度影响相对较小，这是由于预实验中已经选择了相对较好的乙醇浓度。正交实验极差分析中的最好实验条件为A2B1C2D3，而从正交实验中得出的优化实验条件为A2B2C2D3，即70%乙醇，温度55℃，总提取时间2h，其中超声萃取30min。

表4 提取温度对总黄酮提取的影响

表5 料液比对总黄酮提取的影响

表6 最佳工艺条件的验证与放大实验

表7 不同极性黄酮类化合物的显色反应

表3 正交实验结果

2.4 提取温度的影响

从正交实验的趋势来看，提取温度对实验结果的影响呈上升趋势，并不能说明正交实验选择的温度已达到最佳，因此，又借助进一步实验考察了提取温度对提取率的影响，结果见表4。

由表4可以看出，55℃为最佳反应温度，这是由于温度过低不利于黄酮类化合物的溶出，而温度过高，黄酮类化合物的结构可能会受到破坏，因而萃取率反而会降低。

2.5 料液比的影响

在确定了上述提取条件后，有必要对物料和提取液的料液比进行考察，表5为料液比与总黄酮提取率的关系。

表5中数据表明，料液比增大，提取率提高，当料液比为1∶25时提取率最高。这是由于料液比较小时，溶液浓度较高，黄酮类化合物提取不完全，而料液比过高时，溶剂的回收时间过长，反而造成了其中黄酮类化合物的损失，由于提取的料液比从1∶15～1∶25之间已无明显差别，因此考虑到提取成本等因素，最终选择料液比为1∶15较为合理。

2.6 最佳工艺条件的验证与放大

通过对正交实验的优化，最终得到全叶青兰的最佳提取工艺为:乙醇浓度为70%，料液比为1∶15，水浴温度55℃，总提取时间2h，期间辅助超声提取30min的条件下萃取两次。表6为对该实验条件的验证和放大。

实验结果表明，优化后的提取条件下，全叶青兰中的总黄酮的含量优于正交实验的结果，且放大实验表明总黄酮的提取收率稳定。

3 全叶青兰总黄酮的定性

为初步考察全叶青兰提取物中总黄酮的种类，对分离得到的不同极性部位的黄酮类化合物又通过其特征显色反应进行了初步定性，结果见表7。

上述结果表明，全叶青兰中可能含有3-羟基、4-羰基或5-羟基、4-羰基或邻二酚羟基的黄酮，其中，乙醚分离的弱极性部分不含邻二酚羟基的黄酮，而乙酸乙酯提取的部分则含有二氢黄酮或二氢黄酮醇类。上述不同溶剂所得到的由弱极性→强极性部位的总黄酮的比例为13.25∶11.2∶41.8∶33.75，说明全叶青兰中的总黄酮类物质是以极性大的糖苷类化合物为主，苷元形式存在较少，这一点与最初选择溶剂时95%的乙醇提取率较低也是一致的。

4 结论

全叶青兰是新疆的一种特色植物资源，本文通过正交实验对全叶青兰中黄酮类化合物的提取工艺进行了优化，得出采用70%乙醇浓度，在料液比为1∶15，提取温度55℃的条件下萃取2h，期间采用超声波辅助萃取30min为最佳提取工艺，在该工艺条件下的验证和放大实验中提取率稳定。对全叶青兰中黄酮类化合物的初步定性分析表明，全叶青兰中的黄酮类化合物以极性较强的黄酮苷类为主，极性相对较弱的游离苷元的含量较低，对全叶青兰中的黄酮类化合物的进一步的分离、纯化和鉴定将是下一步工作的重点。

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Study on extraction process of flavonoids from Dracocephalum integrifolium Bge.

QUAN Chun-xi，LIU Xiu-ying，LIU Yu-mei*，SU Jing-xiu
(College of Chemistry and Chemical Engineering，Xinjiang University，Urumqi 830046，China)

Extraction process of flavonoids from Dracocephalum integrifolium Bge.were obtained combining with orthogonal design methods and single-factor experiment，namely was 70%alcohol(v/v)，1∶15 ratio of material to liquid，55℃，the total extraction time of 2h，30min treatment by ultrasonic-wave assistant.Based on the conditions，the extraction yield of flavonoids was about 25mg/g.This confirmed that the optimized condition was suitable and feasible.A preliminary separation process was carried out by extracting concentrated ethanol extract with different solvents which have varying polarity.The qualitative analysis results showed that all fractions contained flavonoids. Non-polar fraction obtained from ether extracts contained no ortho-diphenolic hydroxyl flavone and medium-polar fraction obtained from acetic ether extracts contained flavanones or flavanonols.The results indicated that the main portion of the flavonoids from Dracocephalum integrifolium Bge.was flavonoid glycosides，and free flavonoids content were low.

Dracocephalum integrifolium Bge.;flavonoids;extraction process;orthogonal experiment

TS201.2

A

1002-0306(2011)03-0312-04

全叶青兰，学名Drococephalum integrifolium，维吾尔语称其为马尔赞居西，为唇形科多年生草本植物。全叶青兰主要生长于昆仑山或天山北坡海拔1200～1300m左右的石质或粘土的向阳山坡上，在次生裸地上成片生长，喜肥沃土壤，于每年的6、7月间盛花期时采集，其地上部分的药用价值最高［1］，临床主要用于治疗气管炎、哮喘等，有清热解毒、镇咳止喘等功效［2-5］。我国中医和维吾尔医对全叶青兰早有应用，从治疗效果上来看，其对支气管哮喘治疗作用显著，在对500名左右不同年龄的各类哮喘病患者的治疗中，总有效率在94%以上，显效率在60%以上，特别是对咳、痰、喘的症状缓解速度快，效果明显［6-8］。传统医学均是将其采用水煎煮或乙醇提取的方法得到的提取物直接服用或采用简单工艺制成片剂、喷剂等使用，1977年版的中国药典即将全叶青兰收录其中［9］，但由于该植物品种主要生长地是在新疆的北疆地区，数量较少，且比较分散，对其中药效成分的研究报道很少［10］。研究表明，全叶青兰的主要药用部分为其中的精油和黄酮类化合物，因此对其中的主要成分的提取工艺的研究，可以为提高该植物的使用价值提供更合理的途径。作者对全叶青兰中的脂溶性成分已采用超临界CO2提取的方法将其分离，本文的重点是通过正交实验的方法研究从全叶青兰的超临界CO2的萃余物中提取其中黄酮类化合物的提取工艺，并对提取物采用不同极性的溶剂进行初步的分离和定性。

2010-02-01 *通讯联系人

全春喜(1987-)，男，在读本科生，研究方向:化学专业。

新疆大学“国家大学生创新性实验计划”项目(091075509)。