火龙果皮总黄酮提取与体外抗氧化作用研究

王晓波，何晓燕，王 梅，刘冬英，陈海珍

(广东药学院公共卫生学院，广东广州510310)

火龙果皮总黄酮提取与体外抗氧化作用研究

王晓波，何晓燕，王 梅，刘冬英，陈海珍

(广东药学院公共卫生学院，广东广州510310)

目的:为火龙果皮总黄酮(PPF)的开发利用提供理论依据。方法:采用乙醇为溶剂，通过单因素实验和正交实验建立火龙果皮总黄酮最佳提取工艺条件，从还原能力、对不同体系产生的活性氧自由基清除效果评价火龙果皮乙醇提取物的抗氧化活性。结果:火龙果皮中总黄酮提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度80%，料液比1∶30，温度80℃，时间0.5h。在最佳工艺提取条件下提取两次，火龙果皮总黄酮的提取率为10.9mg/g。体外抗氧化实验结果表明，火龙果皮总黄酮对超氧阴离子自由基和羟自由基具有较强的清除能力，对·OH＞O-2·，还原能力与VC相当，弱于BHT。结论:火龙果皮总黄酮具有较强的体外抗氧化活性，作为天然抗氧化剂具有一定的开发利用价值。

火龙果皮，总黄酮，提取，体外抗氧化活性

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜火龙果 购于广州市果品市场，洗净、剥皮，火龙果皮放入鼓风电热恒温干燥箱80℃干燥至恒重，粉碎机粉碎，过60目筛，装密封袋备用;芦丁 生化试剂，国药集团化学试剂有限公司;实验用水 二次蒸馏水;其余均为国产分析纯。

MP120-2电子分析天平 上海天平仪器厂; DL-228多功能食物搅拌机 广州隆特电子有限公司;SHA-B 600型三用水箱 金坛市富华仪器有限公司;KA-1000离心机 上海安亭科学仪器厂; SH2-D(Ⅲ)循环水式真空泵 巩义市予华仪器责任有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;722型分光光度计 上海棱光技术有限公司; 101A-1ET电热恒温鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司。

1.2 标准曲线的建立［4］

本实验确定以芦丁为标准对照品制作标准曲线。精密称取芦丁对照品10mg，置于25mL容量瓶中，用80%乙醇溶解并定容，摇匀，配制成浓度为0.4mg/mL的芦丁标准溶液。分别精确吸取上述芦丁标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于10mL容量瓶中，加5%NaNO3溶液0.3mL，放置6min，再加10%Al(NO3)3溶液0.3mL，放置6min，加4%NaOH溶液4.0mL，加水至刻度，摇匀，放置15min后于波长511nm处比色测定吸光度A，试剂为空白参比。

1.3 火龙果皮总黄酮提取工艺

1.3.1 单因素实验［5］称取0.5000g火龙果皮干粉于碘量瓶中，以乙醇溶液为溶剂，在恒温水浴锅中进行提取，然后提取液以3000r/min离心5min，取上清液定容，按照标准曲线法显色测定其吸光值，计算提取率并进行比较。分别改变料液比、提取温度、乙醇浓度和浸提时间等实验条件，考察其对总黄酮提取率的影响。

1.3.2 正交实验［6］在实验中，由于各因素之间相互交叉影响，因此为全面考虑乙醇浸提法的工艺参数，根据单因素实验的结果，确定以乙醇浓度、提取温度、料液比和浸提时间做4因素3水平的正交实验，以得出最佳提取工艺条件。正交实验因素和水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.3.3 总黄酮含量的测定［7］准确称取一定量火龙果皮干粉，以乙醇浸提法按最佳工艺条件进行总黄酮的提取，浸提两次，提取液经过滤、合并、真空浓缩、石油醚和乙酸乙酯除杂、80℃干燥并粉碎后得粗黄酮粉。

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法。将粗黄酮粉配制成一定浓度，精确吸取样品溶液1.0mL置于10mL的容量瓶中，然后按与标准曲线相同的方法测定样品溶液的吸光度，用标准曲线方程计算出提取液总黄酮质量浓度，根据下列公式计算提取率Y［10］。

式中，Y-火龙果皮总黄酮类物质提取率;C-提取液总黄酮质量浓度，mg/mL;V-提取液体积，mL; W-火龙果皮粉末质量，g;a-稀释倍数。

1.4 火龙果皮总黄酮体外抗氧化活性测定方法

采用化学体系测定其对超氧阴离子自由基(O2-·)、羟基自由基(OH·)的清除能力及火龙果皮总黄酮的还原能力，研究火龙果皮总黄酮的抗氧化活性。

1.4.1 清除超氧阴离子自由基(O2-·)能力测定 根据文献［8］采用邻苯三酚自氧化的方法，比色管中加入0.1mol/L Tris-HCl缓冲溶液和二次蒸馏水，于25℃恒温20min后加入25℃预热过的80mmol/L邻苯三酚(对照管用10mmol/L盐酸代替)，迅速摇匀，立即倾入光径1cm比色杯中，在波长420nm处每0.5min测定1次吸光度A0。共测4min。计算邻苯三酚自氧化管吸光度值随时间的变化率ΔA0。

清除超氧阴离子能力计算公式:

清除率(%)=(ΔA0-ΔA1)/ΔA0×100%

式中，ΔA0-邻苯三酚自氧化速率;ΔA1-加样后邻苯三酚自氧化速率。

1.4.2 清除羟基自由基(·OH)能力测定［9］参照Fenton反应建立·OH自由基产生模型。在10mL具塞试管中加入5mL 0.2 mmol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液，1mL 0.75mmol/L邻二氮菲溶液，1mL 0.75mmol/L FeSO4溶液和2mL样品溶液，混匀后，加入1mL 3% H2O2启动反应，于37℃水浴中反应 60min后，在536nm处测定其吸光度A0，以1mL的去离子水代替H2O2重复上述操作，测得A1，以同浓度的样品溶液为对照品，测吸光值A2，按照下列公式计算清除率。

清除率(S，%)=(A2-A0)/(A1-A0)×100%

1.4.3 还原能力测定［10-11］采用普鲁士蓝法测定还原力，利用铁氰化钾K3Fe(CN)6还原成亚铁氰化钾K4Fe(CN)6，亚铁氰化钾再与Fe3+作用，生成亚铁氰化铁(普鲁士蓝)，在700nm处检测普鲁士蓝的吸光度，以表示还原力的大小，吸光度越高，样品的还原力就越强。

取2.5mL不同浓度的黄酮提取液于试管中，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH6.6)和2.5mL 1%K3Fe(CN)6溶液，于50℃水浴20min后快速冷却，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液(TCA)，以3000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸馏水，0.5mL 0.1%FeCl3溶液，充分混匀，静置10min后，在700nm下测定其吸光度值(以蒸馏水代替样品的混合液作参比溶液)，吸光度值越高，还原力越强。同法测定抗坏血酸和BHT的还原力。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

以芦丁为对照品制作标准曲线，吸光度Y与芦丁含量X(mg/mL)间的回归方程为:

Y=11.039X-0.001，R2=0.9997。由R2可以看出用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定总黄酮的结果稳定可靠，以芦丁为标准品时，在0～0.4mg/mL浓度范围内线性较好。芦丁标准曲线如图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 单因素实验

2.2.1 料液比对提取率的影响 称取5份样品，按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，乙醇浓度70%，在70℃恒温水浴锅中水浴浸提1h，提取液离心后取上清液，按标准曲线法测定吸光度，计算提取率进行比较，提取结果见图2。

图2 料液比对火龙果皮总黄酮提取率的影响

由图2可知，在实验料液比范围内，随着料液比的增大，提取率越高，但当溶剂量达到能将黄酮基本溶出时，再增加溶剂将不会使提取率提高，并且溶剂用量过大也会给后续的浓缩等操作带来不便。火龙果皮总黄酮提取率在料液比为1∶40时达到最大值(6.262mg/g)，而后减小。综合考虑，确定为1∶40的料液比为佳。

2.2.2 提取温度对提取率的影响 称取6份样品，按料液比1∶40，乙醇浓度70%，分别在50、60、70、80、90、100℃恒温水浴锅中水浴浸提1h，提取液离心后取上清液，按标准曲线法测定吸光度，计算提取率进行比较，提取结果见图3。

图3 提取温度对火龙果皮总黄酮提取率的影响

由图3看出，随着提取温度的升高，火龙果皮总黄酮提取率也随之增加，在80℃时提取率达到最大值(6.678mg/g)。但当提取温度超过80℃后，提取率开始下降，这可能是因为过高的温度导致了黄酮类化合物的理化性质发生了一定的改变，同时乙醇挥发严重。综合考虑，提取温度以80℃为宜。

2.2.3 乙醇浓度对提取率的影响 称取6份样品，按料液比1∶40，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%、100%，在70℃恒温水浴锅中水浴浸提1h，提取液离心后取上清液，按标准曲线法测定吸光度，计算提取率进行比较，结果见图4。

图4 乙醇浓度对火龙果皮总黄酮提取率的影响

从图4中可以看出，在乙醇浓度较低时，火龙果皮总黄酮的提取率随着乙醇浓度的升高而提高，当乙醇浓度达到80%时，提取率达到最高(6.457mg/ g)。随后，提取率随乙醇浓度的增加而降低，这可能是因为高浓度的乙醇使更多的杂质溶出，从而导致黄酮类化合物的溶解量减少。因此提取火龙果皮总黄酮，选择乙醇浓度80%为宜。

2.2.4 浸提时间对提取率的影响 称取5份样品，按料液比1∶40，乙醇浓度70%，分别在70℃恒温水浴锅中水浴浸提0.5、1、1.5、2、2.5h，提取液离心后取上清液，按标准曲线法测定吸光度，计算提取率进行比较，结果见图5。

图5 浸提时间对火龙果皮总黄酮提取率的影响

由图5可知，火龙果皮总黄酮提取率随时间的增加而降低，在1h时提取率有最大值(6.204mg/g)，在基本达到渗透平衡后，时间继续增加提取率反而有所下降。因此，提取火龙果皮总黄酮，选择浸提时间1h为宜。

2.3 正交实验

在单因素实验基础上，选择乙醇浓度、提取温度、料液比和浸提时间4种因素依照表1设计L9(34)正交实验，确定9组不同的实验组合，分别得到火龙果皮中总黄酮的提取率，见表2。

从表2中极差数据R可知，乙醇浓度、提取温度、料液比和浸提时间这4种因素对火龙果皮总黄酮得率影响主次顺序为:乙醇浓度＞提取温度＞浸提时间＞料液比，最佳提取条件为:乙醇浓度80%，浸提时间0.5h，提取温度 80℃，料液比 1∶30，即A2B3C1D1。按正交实验所得最佳工艺条件平行实验5份，经计算，总黄酮平均提取率为6.611mg/g，RSD =4.536%，重复性好。根据正交实验得出的最佳提取工艺条件，提取两次，由火龙果皮干粉得到棕色粉末状固体，其中总黄酮的提取率为10.9mg/g。

表2 正交实验结果

2.4 火龙果皮总黄酮体外抗氧化功能实验采用邻苯三酚自氧化法、邻二氮菲法和铁氰化钾还原法分别测定对超氧阴离子自由基(O2-·)、羟基自由基(·OH)的清除作用和还原能力，并与同等条件下的VC、BHT的抗氧化能力进行比较。

2.4.1 清除超氧阴离子自由基(O2-·)能力测定 该体系中邻苯三酚在碱性条件下自氧化形成中间产物超氧阴离子自由基，此自由基能促进邻苯三酚的自氧化，因此通过测定某物质对邻苯三酚自氧化的抑制作用，即可表征其对超氧阴离子自由基的清除作用。

由图6可知，在0.1～0.6mg/mL范围内，火龙果皮总黄酮对超氧阴离子的清除率有较好的量效关系。对其曲线进行拟合得方程:Y=11.032x-5.322，R2= 0.9884，相关性好，根据拟合方程求出火龙果皮总黄酮清除率为50%所需的样品浓度［16］，即为 IC50= 0.5176mg/mL。VC的回归方程分别是Y=-332.52x2+398.96x-21.39，计算出IC50=0.2191;BHT拟合方程为:Y=14.65x-4.2393，计算得IC50=0.3235mg/mL，可以得出三者对超氧阴离子自由基的清除能力为:火龙果皮总黄酮清除能力弱于VC和BHT，0.5 mg/mL火龙果皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除能力与0.4mg/mL BHT相当，与0.2mg/mL VC相当。

图6 火龙果皮总黄酮对超氧阴离子自由基的清除作用

2.4.2 清除羟基自由基(·OH)能力测定 ·OH是人体生命活动中多种生化反应的中间代谢产物，是目前所知活性氧中对生物体毒性最强、危害最大的自由基。实验利用Fenton反应产生的·OH来检测火龙果皮总黄酮清除·OH的能力。

在Feton体系中，火龙果皮总黄酮、VC、BHT对·OH均有较强的清除能力，且随着浓度增加而增加。火龙果皮总黄酮浓度与清除率拟合得方程:y= 14.45x-3.804，R2=0.9946，计算得IC50=0.2979mg/mL; BHT的拟合方程得:y=900.14x2+51.63x+1.961，计算得IC50=0.2041mg/mL，VC拟合方程为:y=10.141x -5.4687，计算得IC50=0.5885mg/mL。比较三者对羟自由基的清除能力为:火龙果皮总黄酮弱于BHT，但是强于VC，即VC＜PPF＜BHT。

图7 火龙果皮总黄酮对羟自由基的清除作用

2.4.3 还原能力测定 由图8的结果可以看出，火龙果皮总黄酮的还原能力很强，在实验浓度范围内，火龙果皮总黄酮的还原能力随着浓度的增加而增强。经过SPSS分析，PPF的还原能力与浓度呈直线相关，回归方程为Y=6.5715x+0.0769，R2=0.9327，BHT的还原能力与浓度呈直线相关，回归方程为y= 12.104x-0.0132，R2=0.9927。火龙果皮总黄酮的还原能力与VC相当，但是明显弱于BHT。

图8 火龙果皮总黄酮的还原能力

3 结论

3.1 以火龙果皮为原料，用NaNO2-Al(NO3)3比色法测定总黄酮结果稳定，以芦丁为标准品时，在0～0.4mg/mL浓度范围内线性较好，标准曲线方程为Y=11.039X-0.001，其R2值为0.9997。

3.2 采用乙醇浸提法建立了提取火龙果皮总黄酮的最佳工艺参数为:乙醇浓度80%，浸提时间0.5h，提取温度80℃，料液比1∶30，在最佳提取工艺条件下，火龙果果皮干粉中总黄酮的提取率为6.611mg/g，提取两次，总黄酮提取率为10.9mg/g。

3.3 火龙果皮总黄酮对超氧阴离子和羟自由基均具有一定的清除作用，且在一定浓度范围内呈现良好的量效关系。对邻苯三酚自氧化体系产生的O2-·的清除能力弱于BHT和VC;对·OH的清除能力弱于BHT强于VC。在还原能力体系中，火龙果皮总黄酮的还原能力与VC相当，但弱于BHT，这可能与火龙果皮中黄酮的结构和类型有关［13］，有待于进一步研究。

本实验结果说明来自火龙果皮的黄酮将有很大的潜力作为天然抗氧化剂的物质资源，该实验结果对进一步推动火龙果食品的深加工改造，提高产品的附加经济值，推动当地的经济发展有促进作用。

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Study on extraction and antioxidative activity of flavonoids in the peel of pitaya

WANG Xiao-bo，HE Xiao-yan，WANG Mei，LIU Dong-ying，CHEN Hai-zhen
(School of Public Health，Guangdong Pharmacy College，Guangzhou 510310，China)

Objective:To provide the theoretical basis for the development and utilization of flavonoids from the peel of pitaya(PPF).Method:Using ethanol as the extraction solvent，crude flavonoids was extracted.The optimum extraction conditions of total flavonoids were determined by single factor experiments and orthogonal test，the antioxidation activity of flavonoids of peel of pitaya was investigated through comparing the eliminating effect to the free-radical of VCand BHT in vitro.Result:Optimum extraction conditions were as follows:the ethanol concentration was 80%，the extraction liquid-material ratio was 1∶30，the extraction temperature was 80℃and the extraction time was 0.5h.Under optimum extraction conditions for twice extraction，the yield rates of the total extraction rates of flavonoids in the dry powder of the peel of hylocereus andatus were 10.9 mg/g.Results:The flavonoids extracted from the peel of pitaya had strong scavenging ability on removing superoxide radicals and hydroxyl radicals，and strong reducing power at the same conditions.Conclusion:Flavonoids of the peel of pitaya had strong antioxidative capabilities in vitro and had potential as a natural antioxidant.

peel of pitaya;total flavonoids;extraction;antioxidative activity in vitro

TS255.1

A

1002-0306(2011)11-0156-05

火龙果(Pitaya)又称为红龙果，为仙人掌科(Cactaceae)量天尺属植物。果皮颜色为紫红色，艳丽迷人，而果肉颜色有白、黄、红等几个不同品种。火龙果在我国台湾栽培较多，已有十多年的历史，目前已在海南、广西、广东、福建等省区兴起，是热带、亚热带的名优水果之一，火龙果具有非常高的营养价值，含有丰富的花青苷、植物白蛋白、VC及膳食纤维，已经成为优良的绿色保健食品［1］。目前，关于火龙果的研究主要集中在果实、果皮中色素、果胶的研究，还未见关于果皮中黄酮类生物活性物质研究。作为水果食用时，火龙果的皮经常当做废物被抛弃掉，而有报道称，采用大孔树脂可以从火龙果果颈中分离纯化出黄酮［2］。黄酮是广泛存在于植物的叶、花、果中的天然色素，是植物次级代谢产物。现代研究发现黄酮类化合物具有广泛的生物学功能，包括抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、预防心血管疾病、防癌抗癌、调节免疫及中枢神经系统抑制剂［3］等诸多药理作用及功效。此外，黄酮类化合物的抗氧化功能与其他外源性抗氧化剂相比，具有无毒、安全和来源广等特点，作为抗氧化剂还被广泛应用于食品加工中。目前从植物中筛选出高效低毒且经济的抗氧化性强的天然抗氧化物质成为现代食品加工、药品、保健品的研究重点。本文拟以火龙果的废弃物果皮为原料，探讨其中黄酮提取的优化工艺方法，并用清除自由基和还原能力评价火龙果皮总黄酮的抗氧化能力，以期开发一种新的天然抗氧化剂，为火龙果的合理综合利用和开发提供一定的理论依据。

2010-05-14

王晓波(1961-)，女，硕士，教授，研究方向:食物营养与功效成份。