山药皂苷及其对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

胡长鹰，于文喜

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

山药皂苷及其对离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用

胡长鹰，于文喜

（暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632）

目的：从山药中分离得到水溶性皂苷，研究其抗心血管疾病功效。方法：利用水煮法提取、乙酸乙酯和正丁醇萃取、反相层析技术从山药中分离皂苷，用1H-NMR、13C-NMR、135DEPT、HMQC和HMBC等方法鉴定其结构。30只大鼠随机分成3组：对照组、缺氧/复氧（I/R）组和山药皂苷样品处理组。建立对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤模型，通过对比左室舒张期末压、左室发展压、左室内压上升的最大速率、左室内压下降的最大速率、心肌单向动作电位和乳酸脱氢酶的变化，研究该皂苷是否对大鼠离体缺血再灌注损伤的心脏具有保护作用。结果：从新鲜的山药根茎中得到（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-β-D-吡喃葡萄糖基（1→4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷，该成分对大鼠离体缺血再灌注损伤的心脏具有显著的保护和修复作用。结论：该化合物为含有5个糖基的双糖链水溶性甾体皂苷，具有抗心血管疾病的功效。

山药，甾体皂苷，缺血再灌注损伤，离体心脏

1 材料与方法

1.1 材料与设备

新鲜山药 购于农贸市场；无水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、石油醚（30～60℃）、正丁醇分析纯级，上海化学试剂有限公司；GF254硅胶板山东烟台芝罘化工厂；大孔吸附树脂AB-8 南开大学化工厂生产；MCI、ODS柱填料 进口分装，由北京绿百草科技发展有限公司提供；LDH试剂盒 东瓯津玛生物科技有限公司；戊巴比妥钠 美国Sigma公司；混合气体（95%O2+5%CO2） 广州气体厂有限公司；Langendorff灌流所用Krebs-Henseleit缓冲液（K-H液） 自配，成分如下（mmol/L）：NaCl 118.4、KCl 4.7、KH2PO41.18、MgSO41.1、NaHCO324.5、CaCl22.55、Glucose 11.1，pH 7.2～7.4。健康雄性Spraugue-Dawley（SD）大鼠 体重250～280g，由广东省实验动物中心提供，动物常规喂养3～5d后开始实验。

Buker Avance 500MHz核磁共振仪 中科院上海有机化学研究所提供；WFJ8-20中药粉碎机 江阴市灵杏药化设备有限公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；BL-420S生物信号采集系统 成都泰盟科技有限公司；台式血压计 上海医疗设备厂；7600全自动生化分析仪 日本日立公司；改良Langendorff灌流装置。

1.2 实验方法

1.2.1 提取与分离 取10kg新鲜的山药根茎，切片，用沸水在料液比为1∶4的条件下，提取3次，共煮沸提取6h；将提取液先用4层纱布过滤，再抽滤除去不溶性杂质，在减压条件下浓缩，即可得薯蓣皂苷的水提取物。用三倍体积的乙酸乙酯萃取直到乙酸乙酯相无色以除去弱极性物质，继续用水饱和正丁醇提取直到正丁醇相无色以除去中等和较大极性物质，剩余部分经浓缩至适当体积后作水相。

将水相部分上AB-8大孔吸附树脂柱（80× 1500mm），先用300mL去离子水洗脱除去水溶性蛋白质及多糖类物质，然后用20%～30%的乙醇梯度洗脱，每50mL收集一份，以正丁醇∶冰醋酸∶水（5∶1∶4）为展开剂，以茴香醛-硫酸溶液为显色剂，经TLC鉴定，Rf相同的洗脱液合并，分成A、B两部分，将A部分上ODS柱（60×600mm），先用200mL去离子水洗脱，再用20%乙醇梯度洗脱，TLC鉴定，选择其中1个含量较高的物质进行纯化，收集洗脱液浓缩至一定体积后再分别反复上 ODS和 MCI柱（30× 450mm），用20%的乙醇溶液洗脱，20mL收集一管，经TLC鉴定纯度。洗脱流速均为1.0mL/min。直到得到1个纯化合物，称为化合物A。

1.2.2 结构鉴定 将所得化合物 A用氘代吡啶（pyridine-d5）溶解后利用核磁共振技术鉴定其结构。

1.2.3 化合物对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤作用实验

1.2.3.1 实验分组 将雄性SD大鼠随机分为3组，每组10只。对照（Control）组：离体心脏灌流至心率和心电正常后正常灌注90min；缺氧/复氧（I/R）组：离体心脏预灌注 30min后，停灌 20min，再复灌40min；薯蓣样品（A）处理组：离体心脏预灌注30min后，停灌20min，再复灌40min。A处理组在复氧时于灌注液中加入50mg/L化合物A。

1.2.3.2 实验步骤 以 1.0% 戊巴比妥钠（30～35mg/kg，ip）麻醉大鼠，迅速开胸摘取心脏并置于0～4℃的K-H液中制动，冲洗冠脉中的血液。主动脉插管，迅速将心脏悬挂于Langendorff装置上，在恒温（37℃）下，以95%O2+5%CO2充分饱和的K-H液进行逆行灌注。心脏复跳后，平衡2～3min，将左心耳剪一小口，沿左心房将充水乳胶球囊插入左心室并固定，乳胶球囊与压力传感器相连。以K-H液预灌至心脏恢复正常跳动后开始实验。预灌时HR＜220bpm（心跳数）和LVSP（左室收缩压）＜60mmHg的心脏弃去不用。

1.2.3.3 缺氧/复氧模型 心脏预灌注30min，停止灌流20min，复灌40min，经BL-420S生物信号采集系统记录缺氧前及复氧20、30、40min不同时间的左心室压力波形。

1.2.3.4 统计学处理 采用SPSS 13.0版统计分析软件进行统计处理，所有计量资料均用均数±标准误（s）表示。

2 结果与讨论

2.1 化合物结构

得到一种化合物A 19.22g。该化合物为白色无定型粉末，溶于甲醇、乙醇，极易溶于水。

1H-NMR谱：二个单峰甲基δH0.98和1.13；三个双峰甲基δH1.06（3H，d，J=6.7Hz），1.40（3H，d，J= 6.7 Hz）和 1.79（3H，d，J=5.9Hz）；一个双键氢δH5.39；五个端基质子信号δH6.26（1H，s），5.24（1H，d，J=7.6Hz），5.14（1H，d，J=7.6Hz），5.03（1H，d，J= 7.5Hz）和4.95（1H，d，J=7.7Hz）。

13C-NMR谱：共有57个碳信号，其中皂苷元有27个碳信号，30个为糖基上碳信号。δC111.0为一个季碳信号，δC122.1和141.2为烯碳信号，表明该化合物为甾体皂苷。与薯蓣皂苷元相比［3-4］，其余信号相似，而其C-26的化学位移值由δC67左右向低场移动至δC75.4，说明该化合物为薯蓣皂苷元的F环开环，并形成糖苷。该化合物的皂苷元部分为原薯蓣皂苷元。

13C-NMR谱：有5个端基碳信号δC106.1，105.1，104.7，101.9和100.1，表明有5个糖基存在。HMBC谱显示δH4.91的质子与C-26（δC75.4）相关，说明δH4.91的端基质子的糖与皂苷元的C-26相连。通过TOCSY和HMQC谱的解析，可对糖链上质子与碳信号进行进一步归属。

通过以上分析并参照文献［3，5-6］，化合物A为（25R）-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5-en-3β，22ξ-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl（1→3）-β-D -Glucopyranosyl（1→4）-［α-L-rhamnopyranosyl（1→2）］-β-D-glucopyranoside。

2.2 化合物抗心血管疾病功效

2.2.1 化合物A对缺氧/复氧心脏左室舒张期末压（LVEDP）的影响 表1结果表明，缺氧/复氧后，大鼠心脏LVEDP明显高于Control组，表明左心室舒张功能下降，且差异极显著（P＜0.01）。复氧20、30、40min A+I/R组的LVEDP与I/R组相比明显下降，差异极显著（P＜0.01），表明化合物A可部分修复离体大鼠心脏I/R造成的心肌舒张功能障碍。

表1 化合物A对缺氧/复氧心脏左室舒张期末压（LVEDP）的影响

表2 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏左室发展压（LVDP）的影响

表3 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏左室内压上升的最大速率（dp/dtmax）的影响

表4 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏左室内压下降的最大速率（dp/dtmin）的影响

图1 化合物A结构

2.2.2 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏左室发展压（LVDP）的影响 表2实验结果：复氧20、30、40min A+I/R组的LVDP与I/R组相比明显升高，差异极显著（P＜0.01），表明化合物A可显著修复离体大鼠心脏I/R造成的心肌收缩功能障碍。

2.2.3 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏左室内压上升的最大速率（dp/dtmax）和左室内压下降的最大速率（dp/dtmin）的影响 表3、表4实验结果：预灌注末期各组大鼠心脏dp/dtmax、dp/dtmin无显著性差异。缺氧/复氧使离体大鼠心脏dp/dtmax明显降低，其中单纯I/R组dp/dtmax降低的幅度最大，随着复氧时间的延长，I/R组无明显回升，与Control组差异显著（P＜ 0.01）。化合物A处理可明显使I/R心脏dp/dtmax升高，复氧至40min时，其dp/dtmax不再有明显上升趋势，但与单纯I/R组相比有显著性差异（P＜0.01）。缺氧/复氧后，大鼠心脏 dp/dtmin与control组相应时点比较显著降低（P＜0.01），化合物A可显著升高缺氧/复氧大鼠心脏的 dp/dtmin（P＜0.01），并且接近control组水平，说明化合物A对dp/dtmax和dp/dtmin指标的修复功能很好。

2.2.4 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏心肌单向动作电位（MAP）的影响 表5实验结果：缺氧/复氧使大鼠心脏MAP明显降低，其中单纯I/R组MAP降低的幅度随复氧时间延长没有好转，复氧40min时为6.72±1.53mv，化合物A处理可明显升高缺氧/复氧心脏MAP，虽不能达到control组水平，但与单纯I/R组相比有差异（P＜0.05），说明化合物A对MAP有修复功能。

2.2.5 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量的影响 表6实验结果：缺氧/复氧使离体心脏冠脉流出液中的LDH含量明显升高（P＜0.01），而化合物A可显著降低缺氧/复氧心脏冠脉流出液中LDH含量（P＜0.01），但不能回复到损伤前的状况。

3 结论

从新鲜的山药中分离得到一种含有5糖的双糖链水溶性甾体皂苷A，结构为（25R）-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-呋甾烷-5-烯-3β，22ξ-二醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→3）-β-D-吡喃葡萄糖基（1→ 4）-［α-L-吡喃鼠李糖基（1→2）］-β-D-吡喃葡萄糖苷。通过对大鼠离体心脏缺血再灌注损伤的保护作用实验研究表明，该化合物对因缺血再灌注损伤的心脏具有保护和修复作用，结合文献［2，7-8］研究结果可以说明，双糖链水溶性甾体皂苷具有治疗心血管疾病的功效，值得开发利用。双糖链水溶性甾体皂苷的作用机理及构效关系值得进一步研究。

表5 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏心肌单向动作电位（MAP）的影响

表6 化合物A对I/R损伤大鼠离体心脏冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）含量的影响

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Protection to ischemia reperfusion injury in rats isolated hearts of steroidal saponin from Dioscorea batatas

HU Chang-ying，YU Wen-xi
（Depertment of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

Objective：To isolate the water-soluble steroidal saponin from Dioscorea batatas and to assess its effectiviness of anti-cardiovascular disease.Methods：The fresh rhizome of Dioscorea batatas was extracted with boiling water and then was extracted with ethyl acetate and n-butanol fraction.The water fraction was isolated by the reversed-phase ODS and MCI column chromatography.The chemical structure was elucidated by means of1H-NMR，13C-NMR，135DEPT，HMQC and HMBC spectroscopic analyses.30 SD rats were randomly divided into three groups：control group（n=10），I/R group（n=10），and saponin preconditioning group（n=10）followed by I/R induction（SY-1）.The following parameters were measured and analyzed：LVEDP，LVDP，dp/dtmax，dp/dtmin，MAP and LDH.Results：One steroidal saponin was isolated from the fresh Dioscorea batatas and its compound was identified as（25R）-26-O-β-D-glucopyranosyl-furost-5-en-3β，22ξ-diol-3-O-β-D-glucopyranosyl（1→3）-β-D-glucopyranosyl（1→4）-［α-L-rhamnopyranosyl（1→2）］-β-D-glucopyranoside.The results showed this compound greatly improved the protecting of I/R injury of isolated hearts in rats.Conclusion：This compound is a water-soluble steroidal saponin with five sugar moieties，double sugar chains.It contributes the great effectivities of anti-cardiovascular disease.

Dioscorea batatas；steroidal saponin；ischemia reperfusion（I/R）injury；isolated heart

TS201.4

A

1002-0306（2011）02-0309-04

山药（Dioscorea batatas）属薯蓣科多年蔓生草本植物薯蓣的块茎，又称淮山、淮山药、怀山药等，含有丰富的蛋白质、维生素和糖类、多种氨基酸、矿质营养成分等，营养丰富，是物美价廉的药食两用佳品。在对山药的实验研究中分离得到了一种强极性的双糖链水溶性甾体皂苷。现有研究表明，甾体皂苷主要分布于薯蓣科植物，具有抗心血管疾病作用［1-2］。本文确定了该皂苷的结构，并初步研究其对抗心血管疾病的功效，以利于更好地认识山药的功效，更好地开发利用山药资源。

2009-09-29

胡长鹰（1968-），女，博士，副教授，研究方向：天然产物提取与功能性食品、食品包装与安全等。

珠海市科技攻关项目（PC20071044）。