青藏高原藏木香总黄酮提取工艺研究及含量测定

杨月琴，彭 敏，胡凤祖，常小平，马海乐，马世震，*

（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁810008；2.中国科学院研究生院，北京100049；3.河南科技大学，河南洛阳471003；4.青海省大通宝库林场，青海大通810100）

青藏高原藏木香总黄酮提取工艺研究及含量测定

杨月琴1，2，3，彭 敏1，胡凤祖1，常小平4，马海乐3，马世震1，*

（1.中国科学院西北高原生物研究所，青海西宁810008；2.中国科学院研究生院，北京100049；3.河南科技大学，河南洛阳471003；4.青海省大通宝库林场，青海大通810100）

目的：研究藏木香中总黄酮的提取工艺及含量测定。方法：采用正交实验进行优选，考察乙醇浓度、溶剂倍数、提取时间等因素对黄酮得率的影响，用紫外分光光度法测定其含量。结果：乙醇浓度是主要的影响因素，最佳提取工艺为选用75%乙醇作为提取溶剂，料液比1∶20，水浴热回流提取2h。以芦丁为对照品，采用分光光度法测定出总黄酮平均含量为0.28mg/g。结论：提取工艺可行；紫外分光光度法简单、快速、准确；为藏木香深度开发提供了科学依据。

藏木香，黄酮，提取工艺，紫外分光光度法

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藏木香 青海省大通宝库林场药材人工种植实验基地栽培，取其根，洗净，自然阴干，粉碎，备用；芦丁对照品 中国药品生物制品检定所；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇 分析纯；超纯水。

Cary 300紫外扫描分光光度仪 美国 Varin；KQ-100E型超声波清洗器 昆山科技有限公司；MOLEMENT元素型超纯水机 上海摩勒生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 正交实验设计提取工艺 根据单因素考察结果、联系生产实际及参考文献资料，认为总黄酮成分的提取与乙醇浓度（因素A）、溶剂倍数（因素B）及提取时间（因素C）3个因素有关，故选择其作为考察因素，用L9（34）正交表进行实验设计、优选，见表1。

表1 总黄酮提取条件因素水平表

1.2.2 含量测定方法 采用分光光度法。黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般具有4位羰基，且呈现黄色。黄酮类化合物多分布于植物中，大多数以苷的形式存在。黄酮类化合物中的3-羟基、4-羟基或5-羟基、4-羰基或邻位酚羟基在亚硝酸盐存在的碱性条件下与Al（NO3）3形成稳定的红色络合物。此络合物可不经分离用分光光度法直接测定样品液中总黄酮的含量。该法中总黄酮的含量的最低检测限为3.5!g/mL。

1.2.2.1 对照品溶液和样品溶液的制备 精密称取芦丁对照品5.0mg，60%乙醇溶解，转入50mL容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.10mg/mL的对照品溶液。

称取干燥的栽培藏木香粉末1.500g，置平底烧瓶中，按照表1正交实验设计方法加入一定浓度、一定体积的乙醇，在80℃恒温水浴中回流提取2次，过滤，合并提取液，滤液减压回收乙醇至无乙醇味，再用60%乙醇定容至50mL，摇匀，即为样品液，备用。

1.2.2.2 分光光度法 精密吸取一定量对照品和样品溶液置于50mL容量瓶中，取2.0mL加60%乙醇至6.0mL，加5%NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10%Al（NO3）3溶液1.0mL，摇匀，放置6min，加10% NaOH溶液10mL，用60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂作空白，测定吸光度。显色后的对照品和样品溶液在400～600nm间扫描，对照品和样品溶液均在510nm处有最大吸收。

2 结果与分析

2.1 含量测定方法研究结果

2.1.1 标准曲线 精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于50mL容量瓶中，各取2.0mL以上述

1.2.2.2 方法测定吸光度（见图1）。

图1 芦丁标准曲线图

以质量浓度（X）与吸光度（Y）进行线性回归，得回归方程为Y=9.53X+0.0462，r=0.9993，结果表明在此范围内线性关系良好。

2.1.2 精密度实验 取同一浓度的对照品溶液5份，各2.0mL依1.2.2.2测定方法测定吸光度（见表2）。

表2 精密度实验结果（n=5）

计算RSD为1.10%（n=5）。结果表明，在该条件下精密度良好。

2.1.3 重复性实验 对5份平行制备的藏木香样品溶液，各取2.0mL依1.2.2.2测定方法测定吸光度，计算总黄酮的平均含量为0.2536mg/g，RSD为1.64%。表3表明，该条件下重现性良好。

表3 样品重复性实验（n=5）

2.1.4 回收率实验 称取同一批藏木香粉末，分别精密加入0.20mg芦丁对照品，按样品溶液制备法制备，并测定含量，计算回收率，结果见表4。

表4 回收率实验结果（n=5）

计算总黄酮回收率的平均值为99.0%，RSD为1.54%（n=5）。测定结果表明，用此方法进行青藏高原藏木香总黄酮的测定，回收率符合要求。

2.2 正交实验提取工艺结果

结果见表5及表6。

表5的结果表明，用正交实验进行优选，得到藏木香总黄酮提取的较优水平搭配为A2B3C3；因素主次顺序A＞B＞C。即藏木香总黄酮较优提取工艺为：选用75%乙醇作为提取溶剂，料液比1∶20，水浴热回流提取2h。表6方差分析结果表明，乙醇浓度对总黄酮含量的影响显著，F值=26.57143＞F0.05；而溶剂倍数和提取时间均对其无显著影响。如从节约资源及时间方面考虑，建议在生产实践中，将较优水平搭配A2B3C3中的B3改为B2，C3改为C1，即用75%乙醇做提取液，料液比1∶15，回流提取1h，重复2次来作为藏木香总黄酮类化合物提取的较优提取工艺。

表5 藏木香总黄酮正交实验结果（n=5）

表6 方差分析结果

2.3 验证实验

按最佳提取工艺A2B3C3进行验证实验，重复5次，结果总黄酮含量分别为 0.273、0.282、0.285、0.279、0.281mg/g，平均为0.28mg/g，RSD为1.60%。

3 结论

3.1 采用分光光度法检测藏木香黄酮类化合物，仪器操作简单方便，芦丁标准溶液浓度Y在2～10μg/mL范围内与吸光度X呈良好的线性关系（Y=9.53X+ 0.0462，r=0.9993）；精密度良好，RSD为 1.10%（n=5）；重现性良好，RSD为1.64%（n=5）；平均回收率为99.0%。

3.2 用正交实验进行优选，得到藏木香总黄酮最佳提取工艺为：选用75%乙醇作为提取溶剂，料液比1∶20，水浴热回流提取2h。乙醇浓度对总黄酮含量的影响显著，F值＞F0.05；而溶剂倍数和提取时间均对其无显著影响，F值＜F0.05。经验证实验得到藏木香总黄酮的平均含量为0.28mg/g。在本研究的基础上，继续开展对藏木香黄酮类物质的作用机制、疗效等研究，为藏木香功能食品及其他产品研发提供科学依据。

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Study on the extraction technique and quantification of total flavonoids in Inula racemosa grown in Qinghai-Tibet plateau

YANG Yue-qin1，2，3，PENG Min1，HU Feng-zu1，CHANG Xiao-ping4，MA Hai-le3，MA Shi-zhen1，*
（1.Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810008，China；2.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Henan University of Science and Technology，Luoyang 471003，China；4.Qinghai Baoku Forestry Farm，Datong 810100，China）

Objective：Aim to study the best conditions of extraction techniques for total flavonoids in Inula racemosa. Methods：The best conditions of extraction technique for total flavonoids were optimized with orthogonal experiment.Developed by ethanol solution with different concentrations，solvent multiples and extraction duration，determination of total flavonoids with UV-spectrophotometry was made.Results：Ethanol concentration was the major factor for determining total flavonoids contents.The best conditions for the extraction techniques of total flavonoids were：75%ethanol which was 20 times of the medicine amount，reflux extracting 2 hours.The yield of total flavonoids in Inula racemosa was estimated at 0.28mg/g.Conclusion：The extraction techniques are feasible and the UV-spectrophotometric method is simple，quick and accurate.

Inula racemosa；flavonoids；extraction technique；UV-spectrophotometric method

TS201.2

B

1002-0306（2011）02-0251-03

藏木香（Inula racemosa Hook.f.）为菊科植物，主要分布在青海、甘肃、西藏、四川等省区海拔2000m以上地区，气味芳香浓郁，具有行气镇痛、健脾消食、温中和胃等功效；藏木香既含有药用成分，又是保健食品敷料和香料的主要成分［1-4］，是一种急需开发利用的资源，其潜在的功能食品开发前景值得我们发掘和研究。目前仅青海、甘肃和四川省相关科研与企业开展了藏木香的人工栽培和繁育技术研究与攻关，其营养价值、药用价值及抗病机理及产品研发等却尚未得到深入的研究［4-5］。黄酮类化合物是中草药的活性成分之一，具有多种医疗、保健功效，可清除体内自由基，延缓衰老和抑制肿瘤，防护紫外线伤害等，除了具有显著的药用价值外，还可作为食品添加剂直接应用在食品中或者作为活性成分开发成为功能性食品。而定性定量检测是对其进行分类和质量评价的前提条件，尽管其他一些现代化的仪器分析方法如毛细管电泳和微胶束毛细管色谱也已经被应用于黄酮类物质的检测，但目前应用最广泛的还是分光光度法及使用C18柱的HPLC系统［6-12］。青藏高原藏木香的黄酮类化合物尚未被开发利用，本研究首次对藏木香根中的总黄酮进行提取工艺研究及含量测定，旨在为藏木香保健品的进一步研究与开发提供基础的科学的理论依据。

2010-05-20 *通讯联系人

杨月琴（1975-），女，硕士，讲师，从事功能性食品开发方面的研究。

河南科技大学特聘教授科研启动费（09004004）；青海省重点攻关项目（2006-034）。