理中汤、人参皂苷Rg1、6-姜酚对Caco-2细胞PepT1转运功能影响的比较

郭文峰，胡 灿，刘 佳，高小玲，陈蔚文

（广州中医药大学 脾胃研究所，广东 广州 510405）

PepT1（Peptide Transporter 1）是蛋白质消化产物小分子肽（二肽、三肽）在小肠吸收的主要转运体，其表达和功能直接影响蛋白质消化产物的吸收水平，我们认为PepT1的功能与“脾主运化水谷精微”是密切相关的。前期动物实验研究中观察到脾阳虚模型大鼠小肠黏膜PepT1转运功能增强，蛋白表达上调，理中汤治疗可逆向调节这种改变［1-2］。本次实验拟从培养Caco-2细胞模型，观察理中汤、人参皂苷Rg1、6-姜酚对体外培养细胞PepT1表达及功能影响，并三者作用的异同。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

14C-Glycyl-Sarcosine，购自 American Radiolabeled Chemicals Inc.，批号：090731，浓度0.1mCi／mL；8-Bromoadenosine-3′，5′-cyclic mono-phosphorothioate，Rp-isomer（简称Rp-8-Br-cAMP），Simga公司产品，批号：029K1157；Glycyl-Sarcosine，Sigma公司产品，批号 142871122009161；PEPT1抗体：ABCAM公司产品；定量PCR用酶SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO公司；Transwell聚碳酸酯膜单细胞层培养板，嵌入膜直径24mm，孔径0.4μm，Corning公司产品，批号： 20109011；定量PCR仪：美国Stratagene公司实时荧光定量PCR仪Mx3005P；MillicellⓇ-ERS跨膜电阻测定仪，美国Millipore公司产品；液体闪烁及发光仪：Perkin Elmer 1450，美国Perkin Elmer公司产品；电泳仪：PowerPac Universal，美国Bio-Rad公司产品；紫外可见光分光光度计：Beckman Coulter DUⓇ520，德国贝克曼公司产品；凝胶成像系统：KADAK Image Station 2000MM，美国Eastman Kodak公司产品；理中汤：党参、干姜、白术、炙甘草购自广州市药材公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室鉴定为桔梗科植物党参Codonosips pilosula（Franch.）Nannf.的根、姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的根茎、菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的根茎、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎；以上4药以1∶1∶1∶1的比例水煎煮2次合并煎液，中性滤纸过滤后，冷冻干燥备用。细胞培养试验需要加药时，称取理中汤冷冻干燥粉末，用PBS溶解后，孔径0.22μm的微孔滤器过滤后加入到细胞培养液中。人参皂苷Rg1，购自购自甙尔塔医药科技有限公司，纯度＞98%，批号 20091027；6-姜酚（6-Gingerol，C17H26O4，CAS.23513-14-6），购自甙尔塔医药科技有限公司，纯度＞98%，批号20091106。

1.2 细胞株

Caco-2细胞，来源于人结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞。购自American Type Culture Collection（ATCC，HTB-37），Lot.No.57850025。

1.3 Caco-2细胞培养，单细胞层模型建立及给药

取代次为25～28的Caco-2细胞。为了测定Caco-2细胞从顶膜向基底膜的14C-Glycyl-Sarcosine吸收转运，将Caco-2细胞种植于跨膜转运6孔培养板微孔滤膜上，初始种植密度为2.0×105／孔，每孔上、下室各加入高糖DMEM培养基2.0mL，隔日更换培养基，参照文献［4］报道方法，待细胞长成致密单细胞层后，再连续培养28d后进行试验。

用跨膜电阻测定方法［4］确定致密单细胞层模型的建立。将跨膜电阻测定仪的两个电极分别插入跨膜转运6孔培养板培养小室的上下室培养液中，读取跨膜电阻值。加入DMEM培养基后，未种植细胞的跨膜转运6空培养板上下室之间的跨膜电阻小于120Ω，聚碳酸酯膜上细胞形成致密细胞层后，其跨膜电阻当大于200Ω。

1.4 14C-Glycyl-Sarcosine转运观测

更换跨膜转运6孔培养板上下小室中的培养基，在上室2.0mLDMEM培养基中分别加入理中汤（用PBS配制成100mg·mL-1的母液）、人参皂苷Rg1（用PBS配制成浓度为5.0mmol／L的母液）、6-姜酚（用 DMSO配制成1.0mM 的母液），使其终浓度分别为1.0mg·mL-1，50μmol·L-1，50μmol·L-1，同时设理中汤加Rp-8-Br-cAMP组，人参皂苷Rg1加Rp-8-Br-cAMP组，6-姜酚加Rp-8-Br-cAMP组，在加入等量理中汤／人参皂苷Rg1／6-姜酚的同时，加入Rp-8-Br-cAMP（用DMSO溶解，配制成浓度为5.0mmol·L-1的母液），使Rp-8-Br-cAMP的终浓度为50.0μmol·L-1，另设正常对照组，DMEM培养基中加入等体积的DMSO，每组设3个复孔。更换培养基及添加受试药的同时，每孔在上室培养基中加入Glycyl-Sarcosine-［Gly-1-14C］及未标记的 Glycyl-Sarcosine，使Glycyl-Sarcosine终浓度为50μmol·L-1。

置于37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度培养箱中培养，分别于5、10、15、30、60、120min时取下室培养基100μL，液体闪烁计数仪测定14C-Glycyl-Sarcosine浓度，计算Caco-2单细胞层对Glycyl-Sarcosine的转运功能，用于评价PepT1对二肽的转运能力。

1.5 膜蛋白中PepT1蛋白表达检测

采用westernblot方法进行。Caco-2细胞种植于6孔培养板中，培养条件和给药方案同“1.4”项下，在给药24h后，移去培养液，PBS漂洗2遍，根据细胞量加入相应的膜蛋白提取缓冲液，4℃轻摇15min，收集裂解液到EP管中，14000r·min-1离心15min，取上清液到新的EP管中。BCA（Bicinchoninc acid assay）法测量蛋白浓度后，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，80V恒压50min，120V恒压电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。低温条件下，100V恒压60～120min转移电泳至聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜，取出杂交膜，TBST（Tris Buffered Saline with Tween 20）缓冲液漂洗5min，3次。5%脱脂奶粉溶液室温封闭1h或4℃过夜。TBST缓冲液洗膜5min，3次。一抗稀释液4℃过夜或37℃孵育2h。TBST洗膜5min，3次。二抗稀释液37℃孵育1h。TBST洗膜5min，3次。蒸馏水漂洗膜2min，弃去液体，共洗3次。将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5min。用试剂盒提供的滤纸吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒曝光，显影。凝胶成像系统测定条带灰度值，以PepT1表达灰度值（IODPepT1）与同组内参GAPDH 灰度值（IODGAPDH）的比值（Ratio＝IODPepT1／IODGAPDH）为各组蛋白表达相对值，用于组间比较。

1.6 荧光定量PCR检测SLC15A1（PepT1mRNA）表达

细胞培养和给药方法同“1.4”项下，受试药作用24h后。收集细胞，提取总RNA。采用紫外分光光度计测定D260／D280方法进行RNA纯度检测，确认RNA较纯，无蛋白质污染。琼脂糖凝胶电泳法进行总RNA完整性检测。

逆转录：在RNase free的PCR管中，取1.0μg总RNA，稀释至12μL。吹打均匀，置65℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；在该PCR管中加入Oligo（dT）0.5μL、Random primer 0.5μL、10mM 三磷酸脱氧核糖核苷（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）2.0μL、RNase inhibitor 0.5μL、5×RT buffer4.0μL、MMLV逆转录酶0.5μL。将上述20μL反应溶液30℃保温10min，42℃保温60min，72℃保温10min。定量PCR：检测序列片段大小。内参片段：18SrRNA-112bp；目的片段：AQP1-151bp。设计的引物：表达PepT1蛋白的mRNA为SLC15A1，qh-SLC15A1-F1：5’CTGCCCTGAAGTGAAGGTGT，qh-SLC15A1-R1：5’GATCTCCGCTGGGTTGATGT。反应体系总体积20.0μL：cDNA（1：15）5.0μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL、2×SYBR Green PCR Master Mix 10.0μL、dH2O4.0μL。反应条件：预变性95℃5min，95℃15s，65℃15s，72℃20s读板，40cycles。融解曲线分析：温度60℃～95℃，每分钟读1次。

以SLC15A1荧光值（qSLC15A1）与内参18s荧光值（q18s）的比值，即SLC15A1相对值＝qSLC15A1／q18s，用以判断SLC15A1表达水平的高低。

1.7 统计方法

2 结果

2.1 单细胞层模型建立

Caco-2细胞融合后，继续常规培养28天，跨膜电阻测定结果表明致密单细胞层模型已经形成，空白对照孔电阻为110Ω，试验孔跨膜电阻测定结果均大于230Ω。表明单细胞层结构致密，可用于模拟肠上皮细胞吸收转运试验。

2.2 各组14C-Glycyl-Sarcosine转运测定结果

液体闪烁计数仪测定14C-Glycyl-Sarcosine量，通过已知浓度样品测定结果制作标准曲线，计算对应Glycyl-Sarcosine浓度。各组别细胞Glycyl-Sarcosine吸收转运量及其与不同时间点之间的关系如表1所示。

表1 各组Caco-2细胞转运Glycyl-Sarcosine量的比较（n＝3，）

表1 各组Caco-2细胞转运Glycyl-Sarcosine量的比较（n＝3，）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与理中汤组比较，3）P＜0.05，4）P＜0.01；与人参皂苷组 Rg1组比较，5）P＜0.05，6）P＜0.01；与6-姜酚组比较，7）P＜0.05，8）P＜0.01。

4±0.54 Rp-8-Br-cAMP组 1.48±0.70 1.98±0.72 2.81±0.56 4.42±0.631） 4.71±0.831）理中汤 1.63±0.31 4.52±0.571） 6.34±0.572） 7.29±0.641） 8.23±0.671）理中汤+Rp-8-Br-cAMP 1.74±0.42 2.68±0.463） 4.13±0.464） 6.45±0.68 6.73±0.432）3）人参皂苷Rg1组 1.81±0.14 3.86±0.341） 5.18±0.542） 8.08±0.752） 8.56±0.422）Rg1+Rp-8-Br-cAMP组 2.11±0.48 2.95±0.325） 3.39±0.655） 4.70±0.706） 4.90±0.362）6）6-姜酚组 1.58±0.42 2.61±0.61 4.49±0.63 6.84±0.461） 8.61±0.542）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP组 1.61±0.45 2.13±0.52 3.76±0.55 6.02±0.59 6.92±0.677）5min 15min 30min 60min 120min正常对照组 1.53±0.14 2.42±0.68 3.15±0.76 5.62±0.20 6.5组别 Glycyl-Sarcosine吸收转运累计量（μmol／孔）

从表1结果可知，理中汤、人参皂苷Rg1及6-姜酚均在不同程度上表现为促进Caco-2细胞转运Glycyl-Sarcosine的作用，与未经药物处理的正常对照组Caco-2细胞比较，其累计转运Glycyl-Sarcosine的总量明显增加（P＜0.05），理中汤及人参皂苷Rg1起效较快，在给药15min后即明显高于对照组，6-姜酚增加Caco-2细胞转运Glycyl-Sarcosine的作用表现较为缓慢，于60min后明显高于正常对照组。

cAMP的抑制剂Rp-8-Br-cAMP对Caco-2细胞转运Glycyl-Sarcosine有抑制作用，且能抑制理中汤及人参皂苷Rg1促进Caco-2细胞二肽转运的作用，理中汤合用Rp-8-Br-cAMP后，Caco-2细胞转运Glycyl-Sarcosine累计总量于15min至120min时分别明显低于单用理中汤处理组。Rp-8-Br-cAMP对6-姜酚的作用不如其对理中汤及人参皂苷Rg1的作用明显。

2.3 各组PepT1蛋白表达westernblot试验结果

图1 PepT1蛋白表达结果

结果表明，Caco-2细胞经理中汤／人参皂苷Rg1／6-姜酚处理24h后，细胞膜PepT1蛋白表达水平均明显增高，而Rp-8-Br-cAMP显著降低膜PepT1蛋白表达水平，Rp-8-BrcAMP与6-姜酚合用，可抑制6-姜酚增加Caco-2细胞膜PepT1表达的作用，其PepT1蛋白表达水平接近空白对照组，低于单用6-姜酚组（P＜0.05）。Rp-8-Br-cAMP与理中汤及人参皂苷Rg1合用对理中汤及人参皂苷Rg1增减Caco-2细胞膜PepT1蛋白表达的作用未见明显影响。见表2。

表2 理中汤对Caco-2细胞膜PepT1蛋白表达的影响（）

表2 理中汤对Caco-2细胞膜PepT1蛋白表达的影响（）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与理中汤组比较，3）P＜0.05；与6-姜酚组比较，7）P＜0.05。

组别 n Ratio值正常对照组3 0.220±0.019 Rp-8-Br-cAMP组 3 0.073±0.0182）理中汤 3 0.326±0.0312）理中汤+Rp-8-Br-cAMP 3 0.248±0.0273）人参皂苷Rg1 3 0.308±0.0281）Rg1+Rp-8-Br-cAMP 3 0.323±0.0192）6-姜酚组 3 0.317±0.0222）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP组 3 0.249±0.0217）

2.4 各组SLC15A1表达荧光定量PCR检测结果

表3结果表明，Rp-8-Br-cAMP处理24h后SLC15A1表达明显下调（P＜0.01）。6-姜酚能明显上调Caco-2细胞SLC15A1表达，但合并应用Rp-8-Br-cAMP后，6-姜酚上调SLC15A1表达的作用被明显抑制。人参皂苷对Caco-2细胞SLC15A1表达的作用表现为下调，理中汤对Caco-2细胞SLC15A1表达作用不明显。

表3 理中汤对Caco-2细胞SLC15A1表达的影响（）

表3 理中汤对Caco-2细胞SLC15A1表达的影响（）

注：与正常对照组比较，1）P＜0.05，2）P＜0.01；与6-姜酚组比较，7）P＜0.05。

组别 复孔数 SLC15A13 2.83±0.18 Rp-8-Br-cAMP组 3 1.94±0.102）理中汤 3 2.61±0.26理中汤+Rp-8-Br-cAMP 3 2.72±0.24人参皂苷Rg1 3 2.31±0.231）Rg1+Rp-8-Br-cAMP 3 2.57±0.356-姜酚组 3 3.71±0.232）6-姜酚+Rp-8-Br-cAMP组 3 2.94±0.217）相对值正常对照组

3 讨论

脾阳虚动物模型小肠黏膜上皮PepT1表达及其转运二肽的能力有明显改变，温阳健脾方理中汤对这种改变具有治疗作用［1-2］。体外培养Caco-2细胞试验研究结果显示［5］，理中汤具有促进正常培养Caco-2细胞转运二肽化合物Glycyl-Sarcosine的作用，该作用可能与其促进胞浆中PepT1蛋白嵌入胞膜中发挥转运二肽的功能有关，该过程调控与胞内第二信使cAMP有一定的关系。

本研究结果中，理中汤全方、人参皂苷Rg1、6-姜酚均可促进Caco-2细胞转运二肽化合物Glycyl-Sarcosine，且与cAMP的抑制剂Rp-8-Br-cAMP合用时表现为明显的抑制，表明二肽化合物经由细胞膜中肽转运载体PepT1的转运与胞内信使cAMP的参与有关。

蛋白表达实验结果中，理中汤全方、人参皂苷Rg1、6-姜酚均能增加Caco-2细胞膜PepT1蛋白表达，合并运用胞内cAMP抑制剂Rp-8-Br-cAMP后，理中汤及6-姜酚上调Caco-2细胞PepT1蛋白表达的效应受到抑制（P＜0.05），而Rp-8-Br-cAMP对人参皂苷Rg1的促Caco-2细胞PepT1蛋白表达并无明显作用。分析其原因，可能与三者作用的具体机制分别相关，具体机制有待进一步研究观察予以揭示。

表达肽转运载体蛋白PepT1的基因为SLC15A1，我们采用荧光定量PCR方法检测了经过Caco-2细胞SLC15A1基因的表达情况，结果表明，6-姜酚对SLC15A1也有明显上调作用，与蛋白表达结果及细胞转运二肽化合物Glycyl-Sarcosine的测定结果基本一致。而人参皂苷Rg1对SLC15A1基因表达的作用反而表现为下调，其结果与二肽转运结果不一致，推测可能由于人参皂苷Rg1可促进胞浆中已有的PepT1蛋白嵌入顶膜发挥二肽转运作用有关，且本次研究受试药作用时间较短，其下调基因表达的效应尚未影响到PepT1蛋白的总量及转运能力。

方剂配伍规律的研究一直是中医药科研的热点，诸多学者从药理学、药物化学等各个领域开展了大量的研究工作，也取得了长足的进展，为阐明中医复方的配伍规律奠定了一定的工作基础。本次研究，通过比较人参皂苷Rg1、6-姜酚及理中汤全方对Caco-2细胞PepT1蛋白转运能力、蛋白及mRNA表达的作用，发现三者作用各有分别，可为理中汤的配伍规律提供实验依据。

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