阿米洛利对压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞膜G蛋白的影响

广东省东莞市常平医院（523573）陈欣和

心肌肥厚是心血管系统常见的并发症[1]，研究心肌肥厚的发生发展机制以及药物逆转心肌肥厚尤为重要。近年研究表明，心肌细胞内的信号转导异常在心肌肥厚的发生发展中起着重要作用[2]。有报道G蛋白的功能异常与高血压、心肌肥厚等疾病的发生有关[2]，而G蛋白亚型在心肌肥厚发生发展中的作用却报道不一[3]；阿米洛利（Amiloride， Ami）是Na+/H+交换体（Na+-H+exchanger，NHE）抑制剂，能使SHR及LVH大鼠心肌细胞内游离钙浓度有一定程度的下降[4][5]，但其对于压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞跨膜信号转导，尤其是对G蛋白亚型表达的影响，未见有报道。本研究运用Westernblot技术，观察LVH大鼠及Ami给药后心肌细胞膜上Gi及GS的α亚基含量的变化，探讨压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞信号异常的机制及Ami 对压力超负荷心肌肥厚大鼠心肌细胞跨膜信号转导的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与仪器 Amiloride，MEM培养基为Sigma公司产品，兔抗Giα购自Santaz公司，Ⅱ型胶原酶，辣根过氧化物酶标记绵羊抗兔IgG购自上海华美生物制品有限公司，硝纤膜为浙江黄岩四青生化仪器厂产品，电泳仪为Bio-Rad公司的Power/PA200型，其他试剂为市售分析纯。

1.2 实验动物及分组 雄性SD大鼠，重约200g，购自中国药科大学实验动物中心；共分4组，每组6只：对照组（大鼠行假手术后，第二周起po同体积的蒸馏水，连续4周）；LVH组（大鼠术后第二周起，po同体积的蒸馏水，连续4周）；Ami组（大鼠术后第二周起，po Ami 5mg·kg-1·d-1，连续4周）。

1.3 大鼠心肌肥厚模型的建立 取雄性SD大鼠，以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（30mg/kg），行腹正中切口，分离肾动脉上方的腹主动脉约1cm长，用7号针头紧贴腹主动脉平行放置，将两者一并结扎后抽出针头，即可使腹主动脉部分狭窄。假手术组分开腹主动脉，结扎后立即松开。术后给予青霉素5万U／只，连续一周预防感染。所有大鼠均饲以常规固体饲料及瓶装饮用水，术后约3～5天，大鼠心肌即开始肥厚，2～3周达稳定。

1.4 心肌细胞分离 大鼠断头处死，迅速取出心脏，置于无钙冰MEM缓冲液（悬浮培养用的Joklik改良MEM培养基）中，清洗残血。按Langendorff 法用含钙MEM（nmol·L-1：MEM+NaHCO310，HEPES 10，CaCl21.25）进行心脏灌流，灌流液中持续通入95%O2+5%CO2混合气体，灌流液温度为36±0.5℃，灌流量为8ml·min-1。5min后改为无钙含酶液（MEM+胶原酶Ⅱ型1mg·ml-1和0.1%小牛血清白蛋白），循环灌流30～40min至心肌松软，色泽变白，然后取下心脏，弃去心房及血管组织，将右心室沿室间隔剪开，左右心室肌组织分别置于原含酶灌流液中，于37℃水浴中温育，轻摇20min，用吸管吹打数次，使组织分散。然后用无钙缓冲液清洗，单层纱布过滤，利用重力作用将死细胞与活细胞分离。细胞悬液镜下70%～80%的细胞为杆状，无或微弱低频收缩，且不被台盼蓝染色。之后对细胞进行复钙，复钙过程应缓慢，约需30min，以防细胞受损。

1.5 Westernblot技术测定心肌细胞G蛋白含量 心肌细胞膜蛋白用SDS-PAGE2X上样液1∶1稀释后，在水浴中煮沸5min。制备3%浓缩胶（H2O1.8ml，30%AA300μl，p H 6.8 T r i s 7 5 0 μ l，1 0%S D S 3 0 l，10%APS50μl，TEMED5μl）和10%分离胶（H2O1.6ml，30%AA2.0ml，p H 8.8 T r i s 1.3 m l，1 0%S D S 5 0 μ l，10%APS50μl，TEMED5μl）,加样量为10μl，Marker4μl，在Bio-Rad公司的Power／PAC200型电泳仪上电泳45min，电泳条件：电压180V，在300mA的条件下将之转移到硝酸纤维素膜上，1h后取下并立即将硝纤膜浸入5%脱脂奶粉中，室温封闭60min。以PBS-T（PBS中含0.05%Tween20）溶液洗3次，每次5min，将硝纤膜浸于兔抗Gsα或Giα中（用PBS-0.3%BSA1:600稀释），于4℃反应过夜。次日将膜以PBS-T洗3次，每次5min，与1：100的绵羊抗兔IgG辣根过氧化物（HRP）结合物于37℃反应75min，再以PBS-T洗膜4次，每次15min，加入新配底物液（6mg 4-氯-1-萘酚，2ml甲醇，10mlTBS，12μlH2O2），37℃显色30min，用蒸馏水冲洗终止反应。用GEL-Doc1000型（美国）凝胶成像分析系统获取图像，以Marker为标准，MA-Analysis软件处理，得各条带的相对密度值。

2 结果

LVH组大鼠心肌细胞膜上Giα、GSα蛋白含量较假手术对照组平均下降了16.5%和22.8%，而Ami组Giα含量与LVH组及对照组间均无差异；Ami组Gsα含量较LVH组分别平均增长了13.2%和33.9%（P＜0.01），但与假手术组间仍有差异。见附表。

附表 Ami对LVH大鼠心肌细胞膜上Giα及Gsα的亚基含量的变化（χ±s，n=6）

3 讨论

心肌细胞内信号转导的异常与LVH的发生发展有着密切联系[2]，一直是研究心肌肥厚的重点。近年来提出的G蛋白-Ca2+途径被认为与高血压、LVH等疾病的发生密切相关[6]。关于心肌功能障碍时Giα的表达情况报道不一， 有报道称在高血压肥大的心肌中Gi含量增加[7]，也有研究表明DOCA大鼠主动脉Giα含量降低[8]。

本研究中， Westernblot测定结果显示在LVH大鼠心肌细胞膜上Giα含量下降，而Gi蛋白能抑制电压依赖性钙通道[9]，因此，Gi的表达降低会使得心肌细胞抑制电压依赖性钙通道的能力下降，导致细胞内钙超载。心血管系统中与Gs结合的受体主要有β1，β2，VIP，5-HT等。配体与受体结合后，能通过Gs蛋白激活腺苷酸环化酶，使得cAMP生成增加，激活PKA，催化蛋白质的磷酸化而诱导细胞分化，抑制细胞的生长增殖。陆方林[10]等用氟化钠和异丙肾上腺素分别刺激 Gs蛋白和β-AR，观察到cAMP的生成能力均显著降低，认为心功能障碍时，β-AR-Gs蛋白复合体功能下降。本研究中，LVH大鼠心肌细胞膜的GSα含量较假手术对照组显著降低。因此，LVH大鼠心功能障碍与G蛋白表达异常密切相关。

Ami作为一种NHE抑制剂可以通过抑制Na+／H+交换，间接抑制Na+／Ca2+交换，并可直接阻断L-型Ca2+通道，减轻细胞内钙超载[5][6]。本研究观察到，Ami给药后仅能轻度增加LVH大鼠心肌细胞膜上的Giα含量，但能使LVH大鼠GSα含量升高，并具有显著性差异。因此，可以认为，Ami治疗心肌肥厚的机制可能与Gi蛋白的调控关系不大，而主要是通过提高Gs的功能激活AC，升高cAMP，从而发挥其保护作用。G蛋白是否并如何参与NHE的表达及活性的调控，及G蛋白中β、γ亚基在心肌肥厚发展中的作用是今后研究所面临的新问题。研究心肌肥厚的发生发展机制，尤其是细胞信号转导机制的研究，对于探讨保护药作用有着重要意义。