顶空固相微萃取-气质联用测定樱桃酒中的挥发性成分

张 妮，肖作兵*，于海燕，朱建才，戴水平

(1.华东理工大学生物工程学院，上海 200237；2.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 200233)

顶空固相微萃取-气质联用测定樱桃酒中的挥发性成分

张 妮1，肖作兵2,*，于海燕2，朱建才2，戴水平1

(1.华东理工大学生物工程学院，上海 200237；2.上海应用技术学院香料香精技术与工程学院，上海 200233)

采用顶空固相微萃取(HS-SPME)与气质联用技术(GC-MS)测定樱桃酒中的挥发性成分，通过对萃取参数的优化，建立快速、准确测定樱桃酒中香气物质的方法。优化后的最佳分析条件为65μm PDMS/DVB萃取头、萃取温度40℃、萃取时间30min、酒精度(体积分数)12%。在此条件下测定中樱狄墨尔樱桃酒中的挥发性成分，共鉴定出65种挥发性物质，其中酯类是樱桃酒中种类最多和含量最多的一类挥发性物质。

樱桃酒；挥发性成分；顶空固相微萃取；气质联用

樱桃富含多种对人体有益的营养成分，有“含桃”的别称，具有很大的开发价值。目前樱桃的贮藏保鲜技术尚不完善，造成大量鲜果积压与腐烂，急需开发樱桃的深加工产品。樱桃酒的研究尚处于初级阶段。用成熟大樱桃酿制的樱桃酒色泽鲜艳，呈玫瑰红色或淡红色，既保持了大樱桃的果香芬芳，又具有自然发酵过程中所产生的清柔醇厚的酯香味。

由于樱桃酒是非蒸馏酒，含有大量难挥发的成分如糖、多元酸及多酚类物质，直接进样会污染气化室及色谱柱，因而必须选择合适的分离技术将风味分析物从樱桃酒中分离出来。

常见的酒中风味成分的分离萃取技术有液-液萃取(liquid-liquid extraction)、静态顶空法(static headspace)、动态顶空法(dynamic headspace)、同时蒸馏萃取(aimultaneous distillation extraction)、吹扫捕集(purge and trap extraction)、固相萃取(solid-phase extraction)和固相微萃取(solid-phase micro-extraction)等[1-3]，这些方法各有利弊，其中固相微萃取技术前处理步骤少、所需样品少、无需有机溶剂，成本低、集样品萃取浓缩为一体、灵敏度高、重显性好[4-5]，更为重要的是，该方法是吸取顶空瓶的上方气体进行进样分析，能最大程度地表达酒体的香气特征，现已被广泛用于葡萄酒[6]、苹果酒[4]、黄酒[7]、白酒[8]以及白兰地[9]等各类酒的挥发性成分的研究。

樱桃酒中的香气成分反映了樱桃酒的质量和生产工艺，对其进行分析检测可指导樱桃酒的生产过程控制，对于提高樱桃酒的风味质量具有重要意义。然而目前国内外对樱桃酒挥发性成分的研究报道还甚少[10]，仅是对樱桃中的挥发性成分有较为具体的研究[11-12]。本实验采用顶空固相微萃取方法结合GC-MS分析樱桃酒中的挥发性成分，分别从萃取头材料、萃取温度、萃取时间、酒精度和NaCl添加量等因素进行优化，为樱桃酒的感官风味评价和生产过程控制提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2008年中樱狄墨尔樱桃酒(干型，酒度(12±1)%)：大樱桃100%原汁发酵 山东尊皇樱桃酒业科技有限公司；NaCl(分析纯) 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

7890A/5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；20mL顶空瓶。

1.3 测定方法

参照相关文献[13]，移取5mL样品于20mL顶空瓶中恒温水浴，分别在不同的萃取头材料、萃取温度、萃取时间、酒精度和加盐量的条件下吸附，之后将萃取头插在气相色谱的高温汽化室中解吸3min，进行GC-MS分析。质谱结果经WILEY谱库检索，仅当匹配度大于80(最大值为100)的鉴定结果才予以报道。采用峰面积归一化法定量计算出各挥发性成分在樱桃酒中的相对含量。

1.4 GC-MS条件

色谱条件：毛细管色谱柱Agilent HP-INNOWax(60m×250μm，0.25μm)；手动无分流进样，进样口温度250℃；程序升温：初始温度35℃，保留3min，以2℃/min的速率升至60℃，再以6℃/min的速率升至250℃，保留5min；检测器温度250℃；载气He，流速1mL/min。

质谱条件：EI电离源，电子能量70eV，扫描范围10～450u，离子源温度230℃；接口温度250℃。

2 结果与分析

2.1 萃取头的选择

比较固定相分别为100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)、65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)、75μm碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)三种萃取头对樱桃酒挥发性成分的萃取效果。萃取头对香气物质的吸附是依据相似相溶原理，即100μm PDMS萃取头对非极性的香气物质有极高的萃取能力，而65μm PDMS/DVB萃取头主要萃取极性的挥发性成分，对胺类、醇类等的吸附和解析的效率较高[14]。

以2008年樱桃酒为样品，向顶空瓶中加入5mL样品，40℃萃取30min[15]。为延长萃取头的使用寿命，萃取过程中不对酒样进行磁力搅拌[16]。

根据除乙醇外的挥发性物质的绝对峰面积总和与峰个数的多少综合考虑来确定最佳的萃取头材料，结果见图1。由图1可知，100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、75μm CAR/PDMS 3种萃取头萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为573.4、1262.7和827.1；峰个数分别为43、55、38个。可见，固定相为65μm PDMS/DVB的萃取头萃取到的芳香物质的种类和含量最高，即萃取效果最好。

图1 不同萃取头对萃取效果的影响Fig.1 Effect of fiber type on volatile extraction

2.2 萃取温度的选择

选用65μm PDMS/DVB萃取头，分别在20、30、40、50℃和60℃萃取30min，考察温度对樱桃酒香气成分的萃取效果。结果见图2。

图2 萃取温度对萃取效果的影响Fig.2 Effect of temperature on volatile extraction

图3 萃取温度对乙醇吸附量的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on ethanol adsorption

由图3可知，5个萃取温度萃取到的挥发性物质的绝对峰面积总和分别为2952.5、6890.9、13844.5、23339.1、16560.8；除乙醇外的峰面积总和分别为467、620.6、1262.7、763.5和659.7；峰个数分别为29、33、55、43、61。一方面，温度升高时较多的分析物会从基质中逸出进入液面上方，增加了香气物质的萃取效率，但超过一定温度萃取量开始降低。其中40～50℃萃取量下降的原因可能是乙醇吸附量增大产生的竞争性吸附造成其他种类物质在萃取头上发生了解吸附，乙醇吸附量随温度的变化趋势见图3；50～60℃乙醇和其他物质的吸附量都明显下降，这是因为温度升高也会降低萃取头吸附分析组分的能力[17]。60℃物质种类增加了很多，可能是高温引起酒体香气物质发生了化学变化。故选择40℃为最佳萃取温度。

2.3 萃取时间的选择

选用65μm PDMS/DVB萃取头，温度40℃，分别考察不同萃取时间10、20、30、40min和50min对樱桃酒香气成分的萃取效果。结果见图4。

图4 萃取时间对萃取效果的影响Fig.4 Effect of time on volatile extraction

由图4可知，5个萃取时间萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为689.8、618.2、1262.7、557.5和848.7，峰个数分别为36、38、55、47、53个。从图4可看出，并不是萃取时间越长越好，从开始萃取到萃取平衡所需时间，由待测组分的分配系数、物质的扩散速率、样品基质、样品体积、萃取头膜厚等因素决定。一般萃取过程中均在刚开始时吸附量增加迅速，出现一转折点后上升缓慢[17-18]，有的甚至出现下降[19]。在本实验的实际操作中，总体香气成分的种类和含量在萃取30min时达到最高值。所以选择30min为最佳萃取时间，这与文献[9,20]报道的结果一致。

2.4 酒精度的选择

酒精度对峰值强度也有影响[21-22]。虽然酒精的影响方式还不确定，但显然，酒精和香气成分会在萃取头上产生竞争性吸附。鉴于此，对样品的酒精度进行优化。选用65μm PDMS/DVB萃取头，温度40℃，萃取30min，分别研究 12%(原酒)、6%(稀释 1 倍)、3%(稀释2倍)样品酒精度对HS-SPME萃取效果影响的研究，结果见图5。

图5 酒精度对萃取效果的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on volatile extraction

3种不同酒精度的樱桃酒中萃取到的除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为1262.7、448.2、412.9，峰个数分别为55、38个和34个。从图5可看出，随着稀释倍数的增加(即样品浓度降低)，除乙醇之外的香气物质种类、峰面积均随之下降，未稀释酒与稀释1倍或2倍的酒其萃取的香气物质的量与种类均差异显著，而稀释1倍与稀释2倍的酒之间差异不显著。所以后续研究对樱桃酒不进行稀释。

2.5 NaCl添加量的选择

有研究表明，在萃取酒中的挥发性成分前进行盐析可增加香气物质在顶空的浓度[23]。硫酸钠或氯化钠等无机盐在水中的溶解度较高，可增大溶液的离子强度，从而降低基体对挥发性物质的束缚，提高酒中有机物质的逸出活度，促使其从液态基质中挥发出来，吸附到萃取头上。但也有研究显示，NaCl的加入会影响基质黏度，降低分析物的扩散速度，产生盐的负效应，即阻碍待测样品中一些半挥发性和难挥发性组分向顶空气体中逸散，从而降低这些物质的提取效果[24]。所以应该对NaCl加入量进行优化。

选用65μm PDMS/DVB萃取头，温度40℃，萃取30min，对NaCl的用量进行优化。研究不同电解质NaC1质量浓度0.00、0.05、0.10、0.20g/mL对HS-SPME萃取效果的影响。结果见图6。

图6 NaCl加入量对萃取效果的影响Fig.6 Effect of sodium chloride concentration on volatile extraction

图7 不同NaCl加入量条件下的色谱图比较Fig.7 Chromatograms of extracted volatiles using different concentrations of sodium chloride

由图6可见，不同NaCl质量浓度萃取到的挥发性物质的峰面积总和分别为1 3 8 44.5、3 0 2 38.8、21842.1、54365.2；除乙醇外的挥发性物质的峰面积总和分别为1262.7、854、1003.2、2357.6，峰个数分别为55、40、45、45个。盐析可提高某几种香气物质的信号强度，但对其他化合物的检测灵敏性降低[16]。本实验中加0.20g/mL氯化钠虽然比不加盐情况下萃取物质总量明显增多，但萃取物质种类减少较多，其中不同加盐量的色谱图见图7。为了能尽可能多地萃取出樱桃酒中的不同挥发性物质，且尽可能减少样品的预处理步骤，因此，后续实验对酒样不进行加盐处理。

2.6 樱桃酒中挥发性物质的定性分析

利用HS-SPME与GC-MS联用法在65 μ m PDMS/DVB萃取头，萃取温度为40℃，萃取时间为30min的条件下对樱桃酒中的挥发性成分进行分离与鉴定。结果见图8和表l。

图8 中樱狄墨尔樱桃酒挥发性成分的总离子流图Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of volatiles in Zhongyingdimoer cherry wine

采用HS-SPME和GC-MS技术对樱桃酒中的挥发性物质进行分离检测，共确定65种挥发性成分，主要包括27种酯类、13种醇类、7种酸类、6种醛类、4种酮类。其中酯类、醇类和酸类分别占香气种类总数的41.54%、20.00%和10.77%，其含量分别占香气成分总量的56.74%、31.13%、2.85%。该樱桃酒含量排在前十位的香气成分依次是3-甲基-1-丁醇(22.46%)、辛酸乙酯(15.87%)、2-羟基丙酸乙酯(7.19%)、癸酸乙酯(6.58%)、乙酸乙酯(5.88%)、丁二酸二乙酯(4.03%)、邻苯二甲酸二丁酯(3.64%)、乙酸(3.24%)、己酸乙酯(3.22%)、肉豆蔻酸乙酯(2.91%)，构成了樱桃酒的主要香气成分。其中，3-甲基-1-丁醇也被确定是白兰地[9]、赛来雄白葡萄酒[16]、红葡萄酒[15]中含量最高的香气物质。

表1 HS-SPME-GC-MS法测定樱桃酒中的挥发性成分Table 1 Volatiles and their relative contents in cherry wine analyzed by HS-SPME and GC-MS

续表1

3 结 论

3.1 对顶空固相微萃取提取樱桃酒中挥发性成分的条件进行优化，得到最佳萃取条件：65μ m PDMS/DVB萃取头、萃取温度40℃、萃取时间30min、酒精度12%，从而建立了快速、准确测定樱桃酒中挥发性成分的方法。该方法简单、迅速，不需有机溶剂，测定结果可真实地反映樱桃酒中挥发性物质的组成。

3.2 在优化好的条件下，利用HS-SPME-GC-MS方法分离鉴定樱桃酒中的香气成分，最终确定65种挥发性物质。其中种类最多的是酯类、醇类和酸类。3-甲基-1-丁醇、辛酸乙酯、2-羟基丙酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、丁二酸二乙酯、邻苯二甲酸二丁酯、乙酸、己酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯是该樱桃酒中主要的挥发性成分。

[1] 吴烈钧. 气相色谱检测方法[M]. 2版. 北京: 化学工业出版社, 2005:52-69.

[2] 王立, 汪正范. 色谱分析样品处理[M]. 2版. 北京: 化学工业出版社,2006: 43-180.

[3] CABREDO-PINILLOS S, CEDRON-FERNANDEZ T, SAENZ-BARRIO C. Comparison of different extraction methods applied to volatile compounds in wine samples previous to the determination by gas chromatography[J]. Analytical Letters, 2004, 37(14): 3063-3084.

[4] 汪立平, 徐岩, 赵光螯, 等. 顶空固相微萃取法快速测定苹果酒中的香味物质[J]. 无锡轻工大学学报, 2003, 22(1): 1-6.

[5] BOUTOU S, CHATONNET P. Rapid headspace solid-phase microextraction/gas chromatographic/mass spectrometric assay for the quantitative determination of some of the main odorants causing offflavours in wine[J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1141(1): 1-9.

[6] 程劲松. 顶空固相微萃取-气相色谱法测定葡萄酒的风味组分[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2003(2): 19-21.

[7] 罗涛, 范文来, 郭翔, 等. 顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱-质谱(GC-MS)联用分析黄酒中挥发性和半挥发性微量成分[J]. 酿酒科技, 2007(6): 121-124.

[8] 赵书圣. 中国白酒中呋喃类化合物的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2008.

[9] 游义琳, 王秀芹, 战吉宬, 等. HS-SPME-GC/MS方法在白兰地香气成分分析中的应用研究[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2008(6): 8-13.

[10] 张艳. 中国樱桃果实酿酒工艺及香气成分变化研究[D]. 雅安: 四川农业大学, 2008.

[11] ZHANG Xu, JIANG Yuanmao. Changes of aroma components in Hongdeng sweet cherry during fruit development[J]. Agricultural Sciences in China, 2007, 6(11): 1376-1382.

[12] OLIVEIRA A L, KAMIMURA E S, RABI J A. Response surface analysis of extract yield and fiavour intensity of Brazilian cherry (Eugenia unifilora L.) obtained by supercritical carbon dioxide extraction[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies, 2009, 10(2): 189-194.

[13] 雷安亮, 钟其顶, 高红波, 等. 静态顶空-气相色谱法测定葡萄酒中主要香气成分研究[J]. 中国酿造, 2009(5): 147-148.

[14] ZANDER A, BISHOP A G, PRENZLER P D. A solid phase microextraction method to fingerprint dissolved organic carbon released from Eucalyptus camaldulensis (Dehnh.) (River Red Gum) leaves[J].Analytica Chimica Acta, 2005, 530(2): 325-333.

[15] 于静, 李景明, 吴继红, 等. 顶空固相微萃取法(SPME)在红葡萄酒香气成分测定中的应用研究[J]. 中外葡萄与葡萄酒, 2006(3): 4-8.

[16] REBIERE L, CLARK A C, SCHMIDTKE L M, et al. A robust method for quantification of volatile compounds within and between vintages using headspace-solid-phase micro-extraction coupled with GC-MS-application on Semillon wines[J]. Analytica Chimica Acta, 2010, 660(1/2): 149-157.

[17] 姜文广. 烟台产区蛇龙珠葡萄中游离态香气物质的研究[D]. 无锡: 江南大学, 2008.

[18] 刘静, 侯英, 杨蕾, 等. HS-SPME-GC-MS联用测定孟买蓝宝石金酒中的香气成分[J]. 酿酒科技, 2008(12): 109-110.

[19] 郭静, 岳田利, 袁亚宏, 等. 顶空固相微萃取在猕猴桃酒香气成分测定中的应用[J]. 农产品加工: 学刊, 2007(3): 34-36.

[20] PANOSYAN A G, MAMIKONYAN G V, TOROSYAN M, et al. Determination of the composition of volatiles in cognac (brandy) by headspace gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Analytical Chemistry, 2001, 56(10): 945-952.

[21] VAZ FREIRE L M T, COSTAS FREITAS A M, RELVA A M. Optimization of solid phase microextraction analysis of aroma compounds in a Portuguese muscatel wine must[J]. Journal of Microcolumn Separations,2001, 13(6): 236-242.

[22] VIANNA E, EBELER S E. Monitoring ester formation in grape juice fermentations using solid phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 2001, 49(2): 589-595.

[23] HOWARD K L, MIKE J H, RIESEN R. Validation of a solid-phase microextraction method for headspace analysis of wine aroma components[J]. American Journal of Enology and Viticulture, 2005, 56(1): 37-45.

[24] DEMYTTENAERE J C R, MARTINEZ J I S, VERHE R, et al.Analysis of volatiles of malt whisky by solid-phase microextraction and stir bar sorptive extraction[J]. Journal of Chromatography A, 2003, 985(1/2): 221-232.

Determination of Volatile Compounds in Cherry Wine Using Headspace-solid-phase Micro-extraction Coupled with GC-MS

ZHANG Ni1，XIAO Zuo-bing2,*，YU Hai-yan2，ZHU Jian-cai2，DAI Shui-ping1
(1. School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China；
2. School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 200233, China)

The volatile compounds in cherry wine were determined using headspace-solid-phase micro-extraction (HS-SPME)coupled with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Extraction conditions such as fiber type, extraction temperature, time, ethanol concentration and sodium chloride added were optimized as follows: 65 μm PDMS/DVB fiber,extraction temperature of 40 ℃, extraction time of 30 min and ethanol concentration of 120 mL/L. Totally 65 compounds were identified in Zhongyingdimoer cherry wine, a Chinese domestic brand, where esters were the most diverse and abundant volatiles.

cherry wine；volatiles；headspace-solid-phase micro-extraction (HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS262.7

A

1002-6630(2011)10-0097-06

2010-08-19

国家“973”前期基础研究基金项目(2009CB226104)；国家自然科学基金面上项目(20876097)

张妮(1985—)，女，硕士研究生，主要从事食品科学与工程研究。E-mail：zhangni1985m@163.com

*通信作者：肖作兵(1965—)，男，教授，博士，主要从事香料香精、食品添加剂和生物工程研究。E-mail：xzb@sit.edu.cn