扩展青霉DNA提取及PCR检测条件的优化

何鸿举，樊明涛,*，刘晓娇，吕丽娟，焦凌霞

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003)

扩展青霉DNA提取及PCR检测条件的优化

何鸿举1，樊明涛1,*，刘晓娇1，吕丽娟1，焦凌霞2

(1.西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2.河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003)

研究扩展青霉DNA的提取及其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测条件的优化。分别采用玻璃珠法、氯化苄法、玻璃珠+氯化苄法提取扩展青霉菌及对照菌株的基因组DNA，经紫外测定和电泳检测实验，分析提取DNA的质量浓度和纯度；同时，根据扩展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因内一段保守序列设计合成一对288bp的扩增引物，并对PCR检测条件进行优化。结果表明：玻璃珠+氯化苄法提取到的DNA质量浓度和纯度较理想，扩展青霉DNA可获得良好的特异性扩增，PCR扩增的最适退火温度为53～59℃，最适引物浓度为0.04～0.16μmol/L，最适模板质量浓度为2.40～5.28μg/mL，dNTPs浓度对PCR扩增影响不大。运用实验所得优化参数检测扩展青霉菌，整个过程仅需3～4h，和传统的培养检测法相比，该方法可有效提高检测效率，可进一步将该方法应用于实践。

扩展青霉；基因组DNA；聚合酶链式反应(PCR)；优化

目前，我国是世界上最大的苹果生产国，同时也是苹果汁生产第一大国，其浓缩苹果汁出口量已占到世界贸易量的60%[1]，但由于我国的苹果汁生产原料主要是残次落果，加之贮藏加工能力不足，导致大量的苹果出现腐烂，致使扩展青霉的污染比较严重，直接影响了苹果汁的质量[2-3]。

扩展青霉(Penicillium expansum)是一种多细胞丝状真菌，是棒曲霉素的主要产生菌[4]，棒曲霉素是一种致癌、致畸毒素[5-6]。传统的扩展青霉检测主要是培养法[7]，耗时长，无法实现快速检测的目的，近年来PCR技术在微生物的检测方面具有明显优势[8-10]，因此，研究如何快速检测棒曲霉素产生菌——扩展青霉，并设法在工艺过程中对其进行控制，减少该棒曲霉素产生菌，对提高苹果汁质量具有非常重要的意义。本实验基于PCR检测特异性的优点，根据扩展青霉多聚半乳糖醛酸酶基因内一段保守序列设计引物，优化扩增条件，获得一套最适扩增扩展青霉DNA的优化参数，以期为实际应用提供理论依据和方法学参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

扩展青霉(Penicillium expansum) 中国普通微生物菌种保藏管理中心；圆弧青霉(Penicillium cyclopium)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、矮棒曲霉(Aspergillus clavatonanicus)、黄炳曲霉(Aspergillus flavipes)、黑曲霉(Aspergillus niger) 西北农林科技大学食品学院微生物实验室。

1000bp DNA Marker、Taq酶、dNTPs、PCR 缓冲液 日本Takara公司；溴乙锭 西安沃尔森公司；DNA提取液(体积分数2% Trition X-100、10g/100mL SDS、100mmol/L NaCl、10mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，pH8.0) 自制。

PTC-200 PCR仪 美国MJ Research公司；Bio-Rad凝胶成像系统 美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养

在无菌操作条件下，将扩展青霉菌和其他菌种接种到察氏培养基(NaNO33.0g、K2HPO41.0g、KCl 0.5g、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O 0.01g、蔗糖30g、琼脂粉20g，加水定容至1L，临用前用乳酸调至pH4.5)，28℃避光培养3～4d，用于提取DNA。

1.2.2 扩展青霉基因组DNA提取方法的筛选

氯化苄法：参照文献[11]略作修改。用接种环从察氏培养基平板上刮取大约100mg菌丝体放入装有400μL DNA提取液的1.5mL离心管中，加150μL 10% SDS、450μL氯化苄原液，旋涡振荡约10min，52℃水浴1h，每10min振荡混匀1次；然后加NaAc(3mol/L，下同)450μL，充分颠倒混匀，冰浴15min，15000r/min离心5min；取上清液，加入与其等体积的冰无水乙醇，－20℃沉淀30min，8000r/min离心10min，弃上清液；沉淀于37℃烘至微干，加100μL灭菌超纯水，溶解DNA，－20℃保存备用。

玻璃珠法：参照文献[12]略作修改。用接种环从察氏培养基平板上刮取大约100mg菌丝体放入装有400μL DNA提取液的1.5mL离心管中，加700mg玻璃珠和400μL Tris饱和酚，旋涡振荡30min，15000r/min离心5min；取上清液，加入与其等体积的酚、氯仿、异戊醇的混合液(25:24:1)，充分颠倒混匀，15000r/min离心5min，抽提2次；取上清液，加入其1/10体积的NaAc及2倍体积的冰无水乙醇，－20℃放置30min，8000r/min离心5min，弃上清液；沉淀加1mL 75%乙醇漂洗1次，于37℃烘至微干，加100μL灭菌超纯水溶解DNA，－20℃保存备用。

玻璃珠+氯化苄法：参照文献[13]略作修改。用接种环从察氏培养基平板上刮取大约100mg菌丝体放入含400μL DNA提取液的1.5mL离心管中，加150μL 10%SDS和450μL氯化苄，并加700mg玻璃珠剧烈振荡30min，直至液体呈乳状；52℃水浴1h，每10min振荡混匀1次；15000r/min离心5min；取上清液，加入与其等体积的Tris饱和酚和氯仿的混合液(1:1)，充分颠倒混匀，15000r/min离心5min，抽提2次；取上清液，加入与其等体积的氯仿，充分颠倒混匀，15000r/min离心5min，重复此操作1次；取上清液，加入与其2倍体积的冰无水乙醇，－20℃静置沉淀30min，8000r/min离心5min，弃上清液；沉淀于37℃烘至微干，加100 μL灭菌超纯水溶解DNA，－20℃保存备用。

1.2.3 引物设计

根据GenBank中扩展青霉菌株的polygalacturonase基因序列，利用Primer 5.0软件设计一对引物，上游引物：5'-CGCCAAGAATACACCAACT-3'，下游为：5'-TCCAAAGATAACGGACGAA-3'，扩增片段长度为288bp。引物由日本Takara公司合成。

1.2.4 PCR扩增及电泳

参照文献[14]调整反应体系(25μL)为：模板DNA 2.5μL，两条引物(10μmol/L)各0.5μL，Taq DNA聚合酶 0.2μL，dNTPs(2.5mmol/L)2.0μL，10×PCR缓冲液2.5μL。反应条件为：94℃预变性5min，解链94℃ 1min，退火55℃ 30s，延伸72℃ 30s，30个循环，终延伸72℃10min。取10μL PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，照相观察。

1.2.5 PCR的特异性检验

采用1.2.2节筛选的方法提取圆弧青霉、皮落青霉、产黄青霉、扩展青霉、黄炳曲霉、矮棒曲霉、黑曲霉、7种真菌的DNA，并采用1.2.4节的体系扩增扩展青霉菌，检验PCR扩增的特异性。

1.2.6 PCR扩增条件的优化

在预实验的基础上分别选取退火温度、引物浓度、模板浓度和dNTPs浓度等因素进行PCR扩增条件的优化实验，以获得最适检测扩展青霉菌的扩增条件。

2 结果与分析

2.1 DNA提取方法的筛选

一般而言，优质的DNA的OD260/OD280值在1.8～2.0之间，紫外测定结果如表1所示。玻璃珠+氯化苄法提取的DNA的OD260/OD280值为1.811，而氯化苄法和玻璃珠法提取的DNA的OD260/OD280值均小于1.8，并且玻璃珠+氯化苄法提取的DNA质量浓度明显高于其他两种方法。电泳结果(图1)表明玻璃珠+氯化苄法提取的DNA有清晰、明亮的条带，而氯化苄法和玻璃珠法的条带很弱。紫外测定和电泳结果均表明玻璃珠+氯化苄法提取的DNA的质量浓度和纯度明显优于氯化苄法和玻璃珠法。因此选取璃珠+氯化苄法作为本实验的DNA提取方法，提取7株试验真菌的DNA，电泳结果(图2)显示均有清晰、明亮的条带，表明均已提取到DNA。

表1 3种方法提取扩展青霉DNA的纯度和质量浓度Table 1 The concentration and purity of Penicillium expansum DNAs extracted by three methods

图1 3种方法提取DNA的电泳结果Fig.1 Gel electrophoresis of Penicillium expansum DNAs extracted by three methods

图2 玻璃珠+氯化苄法提取试验真菌DNA的电泳结果Fig.2 Gel electrophoresis of DNAs from Penicillium expansum and 6 control fungi extracted by glass bead combined with benzyl chloride method

2.2 PCR的特异性检测

应用试验设计的引物对扩展青霉和其他真菌的DNA进行PCR扩增，结果如图3所示。结果显示，只有扩展青霉菌扩增出了288bp大小的特异性目的条带，而其他6种真菌均未得到任何扩增条带，并且经多次实验，重复性良好。由此可得出在该实验条件下，此引物建立的PCR检测方法对扩展青霉具有特异性。

图3 扩展青霉的PCR特异性检验Fig.3 Specificity of primers designed in this study to Penicillium expansum

2.3 最适退火温度筛选

退火温度是PCR反应条件的最关键因素，由最适退火温度筛选的实验结果(图4)可看出，退火温度在52～61℃之间时都能获得较好的扩增，但温度过低出现了非特异性条带，可能出现假阳性结果；退火温度过高，由图4可看出，PCR的扩增效率似乎有所降低，条带亮度有所下降，因此本实验获得较理想的退火温度是53～59℃。以下实验的退火温度均选用57℃。

图4 PCR最适退火温度的筛选Fig.4 Effect of annealing temperature on PCR detection

2.4 最适引物浓度筛选

合适的引物浓度对PCR扩增有很重要的作用，如图5所示，在所选引物浓度条件下均扩增出了明显的目的条带，但不同引物浓度对是否有二聚体形成却有不同的作用，当引物浓度分别为0.04～0.16μmol/L时，基本无引物二聚体形成；当引物浓度达到0.20～0.28μmol/L时，似乎有微弱的引物二聚体；当引物浓度达到0.32～0.40μmol/L时，引物二聚体非常明显。因此，此引物适宜的浓度为0.04～0.16μmol/L。引物浓度过高易出现非特异性条带。以下实验中引物浓度均选用0.16μmol/L(对应的PCR上样量为0.40μL)。

图5 最适引物浓度筛选Fig.5 Effect of primers concentration on PCR detection

2.5 最适模板质量浓度筛选

在退火温度57℃、引物浓度0.16μmol/L的情况下，进行最适模板浓度的筛选实验，结果见图6。当模板质量浓度为0.8μg/mL时，没有扩增出目的条带；当质量浓度在1.44～5.28 μg/mL范围内时均扩增出了明显的目的条带，但条带的亮暗程度不同：模板质量浓度为1.44～1.92μg/mL时获得的扩增条带亮度较弱，模板质量浓度增加至2.40～5.28μg/mL时获得的扩增条带清晰明亮。因此，质量浓度在2.40～5.28μg/mL之间时，PCR扩增效果良好。模板质量浓度过低会影响PCR的扩增效率。以下实验中模板质量浓度均选用2.40μg/mL(对应的PCR上样量为2.50μL)。

图6 最适模板质量浓度筛选Fig.6 Effect of template concentration on PCR detection

2.6 最适dNTPs浓度筛选

从图7的最适dNTPs浓度筛选实验结果可以看出，在所选dNTPs浓度条件下均扩增出了明显的目的条带，而且条带的亮度基本一样，说明dNTPs浓度对PCR扩增结果的影响不大，只要有足够量的dNTPs就可以达到扩增目的，实际工作中选择较小的dNTPs浓度以节约试剂。

图7 最适dNTPs浓度筛选Fig.7 Effect of dNTPs concentration on PCR detection

2.7 优化参数条件下的PCR检测

选取优化后的参数(退火温度为55℃，引物浓度为0.04μmol/L，模板质量浓度为3.36μg/mL，dNTPs浓度为0.15mmol/L)。对扩展青霉和其他真菌进行PCR检测，结果如图8所示。扩展青霉获得了良好的特异性扩增，且扩增条带明亮清晰，而其他真菌均未获得扩增条带，说明优化的PCR参数适合扩展青霉的检测。

图8 优化参数条件下的PCR检测Fig.8 PCR detection of Penicillin expansum under optimized conditions

3 讨 论

现有的参考文献中，真菌DNA的提取方法已报道很多[15-17]，氯化苄法和玻璃珠法就是其中两种，而提取真菌DNA的首要一步就是破碎细胞壁，破壁效果是否良好直接影响着DNA的提取效果：氯化苄法是基于氯化苄和真菌细胞壁中的多糖反应以达到破碎细胞壁的目的，属化学法破壁；玻璃珠法是借助玻璃珠相互之间的震动挤压和剪切力以破碎细胞壁，属物理法破壁。将这两种方法分别单独用于破碎本试验中扩展青霉菌的细胞壁，以达到释放DNA的目的，但是由表1和图1可知，这两种方法的破壁效果并不理想，没有使扩展青霉菌中的DNA完全释放出来，这将会影响到后续的PCR检测实验。借鉴文献[13]的方法，将氯化苄法和玻璃珠法结合起来破壁，结果显示提取的DNA质量明显优于两种方法分别单独使用时提取的DNA质量，说明氯化苄和玻璃珠联合破壁效果要好于两种方法单独破壁，化学法和物理法的双重作用使DNA得到了比较充分的释放，可满足PCR检测的需要。

在现有的扩展青霉PCR检测研究报道中，扩增引物及PCR检测条件各不相同，Paterson[10]和Marek[14]分别利用引物ISO和引物POL对扩展青霉的PCR检测进行了初步的研究，袁晖等[18]利用真菌通用引物探讨了扩展青霉的PCR检测，然而，采用这几种引物及其相应的PCR检测体系并不能特异性的扩增本实验中的扩展青霉菌，为此，本实验根据扩展青霉polygalacturonase基因内一段保守序列重新设计了一对288bp的扩增引物，并在Patrick的研究基础上优化了PCR检测条件。扩增结果显示PCR检测扩展青霉菌获得了良好的特异性，优化结果显示PCR最适退火温度为53～59℃，最适引物浓度为0.04～0.16μmol/L，最适模板质量浓度为2.40～5.28 μg/mL，而dNTPs浓度对PCR扩增影响不大，运用实验所得优化参数检测扩展青霉菌，整个过程仅需3～4h，和传统的培养法检测相比，有效地提高了检测效率。建立的这套检测体系可为进一步开展扩展青霉的分子生物学研究及实际应用提供理论借鉴。

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Optimization of DNA Extraction and PCR Detection from Penicillium expansum

HE Hong-ju1，FAN Ming-tao1,*，LIU Xiao-jiao1，LLi-juan1，JIAO Ling-xia2
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；
2. College of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

The genome DNAs of Penicillium expansum and 6 control fungi were extracted by glass bead method, benzyl chloride method and their combination, respectively. The concentration and purity of DNAs were analyzed by UV spectroscopy and gel electrophoresis. Meanwhile, a pair of primers with a size of 288 bp were designed and synthesized based on a conservative sequence of Penicillium expansum's polygalacturonase gene to conduct the PCR detection. The results showed that combined use of glass bead and benzyl chloride was more effective than either alone. Good specific amplification of DNA was obtained, and the optimal range of annealing temperature was between 53 ℃ and 59 ℃, and the optimal range of primer concentration between 0.04 μmol/L and 0.16 μmol/L, and the optimal range of template concentration between 2.40 μg/mL and 5.28 μg/mL.Meanwhile, dNTPs concentration had little influence on PCR amplification. The method requiring only 3 to 4 hours could evidently enhance detection efficiency when compared to traditional methods. As a result, it has promising potential to be further applied in practice.

Penicillium expansum；genome DNA；polymerase chain reaction (PCR)；optimization

Q939.5

A

1002-6630(2011)10-0115-05

2010-07-07

教育部博士点基金项目(200807120017)；陕西省科技攻关项目(2007K01-12)

何鸿举(1983—)，男，硕士研究生，主要从事食品生物技术研究。E-mail：hhj1030@nwsuaf.edu.cn

*通信作者：樊明涛(1963—)，男，教授，博士后，主要从事食品微生物及食品安全研究。E-mail：mingtaofan@tom.com