新城疫病毒LaSota疫苗株全基因克隆和序列分析

卢艳 赵恒 闫红岩 司红丽 何成强 山东师范大学生命科学学院，济南 250014

新城疫病毒LaSota疫苗株全基因克隆和序列分析

卢艳 赵恒 闫红岩 司红丽 何成强 山东师范大学生命科学学院，济南 250014

本文通过RT-PCR的方法对家禽所的新城疫病毒LaSota疫苗株的全长进行分段克隆，通过测序获得全长序列，该病毒全长为15186bp，将全长序列提交到NCBI GenBank中获得序列登录号为JF950510，将其与之前已提交到NCBI GenBank中的LaSota株全长序列（登录号为AF077761）比较，核苷酸序列有135处变异，各个蛋白的氨基酸序列总共有61处变异。全基因克隆和序列分析为下一步研究LaSota株提供一个良好的方法。

RT-PCR;新城疫病毒;基因组序列

新城疫( Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)引起的一种烈性病毒性传染病，是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一[1]。包含6个基因，依次为3’-N P-P-M-FH N-L-5’，分别编码核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphoprotein，P）、基质蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F）、血凝素-神经氨酸酶（hemagglutininneuraminidase，HN）、大聚合酶蛋白（large polymerase protein，L）[2]。本研究对其基因组序列进行测定，这对我国NDV开展分子流行病学和跨种间致病研究提供科学资料，为今后研制有效的NDV疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 病毒及分子生物学相关材料

Ⅳ系La Sota是山东省农科院家禽所袁小远老师惠赠的。SPF（specific pathogen free，无特定病原体）鸡胚购买于山东省农科院。p M D 18-T，T 4连接酶购买于TaKaRa公司， E.coli DH5 α为本实验室保存，DNA纯化回收试剂盒购买于天根公司。

1.2 病毒的纯化与收集：用PBS稀释La Sota疫苗然后接种于9～11日龄的SPF鸡胚中扩增并收集病毒，并通过血凝实验测得病毒效价为9。

1.3 引物设计：根据GeneBank上公布的全基因组序列将全长分别分12段扩增La Sota株基因组，使用primer5设计每个片段的上下游引物。引物序列如表1。

1.4 RNA的提取及RT-PCR：按照TRNzolA+总RNA提取的实验步骤抽提RNA，按照厂商提供的TransScript twostep RT-PCR supermix说明书提供的方法进行RT-PCR。

1.5 克隆测序：将扩增得到的各个cDNA片段连接到pMD18-T载体，筛选含目的片段的单菌落，阳性克隆送北京华大测序。将测序结果依次拼接后得到全长的基因组序列。

2 结果

2.1 新城疫病毒基因组各片段的克隆和鉴定

利用R T-P C R扩增出了包含了L a Sota全基因序列的12个片段，经过琼脂糖凝胶电泳检测到与预期大小相同的条带，各片段克隆到pMD18-T载体上，用菌落PCR和测序的方法检测出阳性克隆。

2.2 NDV La Sota疫苗株全基因组序列测定

我们测通了NDV LaSota疫苗株全基因组各段cDNA阳性克隆，运用DNAstar拼接出全基因组序列，NDV LaSota疫苗株全长15186bp，符合6的倍数。含有6个开放阅读框，各开放阅读框的大小分别为：1470bp，1188bp，1095bp，1662bp，1734bp，6615bp。我们将拼接完的La Sota的全基因组序列提交到GeneBank上，基因组序列号为JF950510。用MEGA5.0对这株病毒的全基因组序列和GeneBank上已提交的相应病毒全基因组序列作比对，发现相似性高达99%。有意思的是，在La Sota株的1223 7b p处多出一个碱基G，而在12326bp处则发生了缺失突变，这一变异可能导致30个氨基酸的改变。其他位置的突变有46处。

表1 NDV La Sota基因片段扩增的引物序列

3 讨论

在我国，主要是广泛接种新城疫疫苗来控制该病的爆发，一些减毒株疫苗如新城疫Ⅳ系（LaSota株）、H株、Rokin株、克隆30，等被广泛用于预防NDV[3]。由于减毒活疫苗易于饮水、喷雾、气雾等使用相对方便，因此常被用于群体免疫，且NDV免疫密度和次数也远远超过世界水平。由于大面积的疫苗使用，新城疫得到了较好的控制，但近些年来，NDV出现了一些新的疫情，即在免疫过的鸡群中，即使能产生高的抗体滴度，新城疫仍时有爆发[4]。大量使用的疫苗株难免流失到环境中，目前，那些散落在环境中的疫苗毒株对新城疫病毒本身造成的影响并没有完全了解。在这里，我们虽然发现了新城疫疫苗株的突变，但是突变后果完全未知，因此我们应该谨慎对待这类新城疫活载体多价疫苗。

本篇论文以家禽所的LaSota疫苗为材料，通过测序得到全长序列。在测序时，我们考虑了PCR过程可能造成基因的变异[5]，故对该病毒基因组的各区段至少测序三次，综合多次测序结果获得其全长基因序列，因此所获得的序列应该能够真实反映了该病毒株基因组的核苷酸序列。将我们得到的序列与之前已提交到N C B I GenBank中的LaSota株全长序列（登录号为AF077761）比较，我们发现的核苷酸的变异，说明疫苗株在自然免疫中就不断发生变异[6]。综上所述表明新城疫病毒在自然界的选择压力与免疫压力下，其部分生物学特性已经发生变化，这可能是病毒对外界环境变化而发生的一种适应性突变的结果。

这些结果为了解我国新城疫病毒疫苗的现状提供了新的信息，也为新型疫苗的研制和开发提供了理论依据。

[1]卡尔尼克BW.禽病学[M].第十版.高福等译.北京:中国农业出版社, 1999.692- 694

[2]徐文．新城疫疫苗的最新研究进展[J].Poultry Science 2008.6:43- 45

[3]王友华．鸡新城疫综合防控措施，动物医院，2010.3:39-40

[4]雍丽．鸡新城疫疫苗应用的研究进展.甘肃畜牧兽医，2010.1:38-40

[5]Alexander,D.J.Newcastle disease [M].Boston:Kluwer Academic Publishers, 1988.147-160.

[6]施少华．番鸭新城疫病毒全基因组序列分析.2006年学术年会，2010.669-672.

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.22.073

山东省高等学校科技计划项目（J09LCD209-12）和山东省优秀中青年科学家科研奖励基金项目（BS2009NY011）（,BS2010NY029）

卢艳。研究方向：微生物专业；

何成强，学历：博士，职称：副教授。