固相微萃取-气相色谱-质谱及气相色谱嗅闻技术分析双孢蘑菇汤的风味活性物质

李 琴，朱科学，周惠明*

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

固相微萃取-气相色谱-质谱及气相色谱嗅闻技术分析双孢蘑菇汤的风味活性物质

李 琴，朱科学，周惠明*

(江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)

测定双孢蘑菇汤的风味活性成分，分析这些风味活性成分对双孢蘑菇汤整体风味的重要贡献。利用顶空固相微萃取技术萃取双孢蘑菇汤的风味物质，通过气相色谱分别与质谱仪和嗅闻仪相联，对风味成分进行分离鉴定，比较不同萃取头的萃取效果及不同极性色谱柱的分离效果。结果表明：三相萃取头(DVB/CAR/PDMS)比两相萃取头(CAR/PDMS)得到的风味成分多7种；极性柱(DB-WAX)较弱极性柱(HP-5)得到的风味成分多3种，并且极性柱分离得到的蘑菇类风味成分比弱极性柱多，而弱极性柱分离得到了更多的吡嗪类化合物。蘑菇汤的主要风味活性物质包括C8类不饱和醇、酮(蘑菇味)、苯乙醛(花香)、2,5-二甲基吡嗪(爆米花味)、2,6-二甲基吡嗪(巧克力味)、正己醛(青草味)、3-甲基丁醛(果香)、2-乙酰噻唑(肉香)等。

双孢蘑菇；风味活性物质；顶空固相微萃取；气相色谱-质谱；气相-嗅闻；极性柱；弱极性柱

食品风味是食品品质的重要指标之一，而挥发性风味物质是影响食品风味的关键。对于风味物质的萃取、分离及测定方法已研究多年，影响其测定结果的因素主要是萃取方法和分离方法。传统萃取方法(溶剂萃取法、蒸馏萃取法)存在萃取时间长、溶剂用量大、成本高、对环境和健康不利等缺陷[1]。近年来，出现的无溶剂萃取方法(固相微萃取、微阱捕集等)，在一定程度上克服了传统萃取方法的缺点，是快速、无损的萃取方法。国内外研究者应用固相微萃取结合气质联用技术(solid phase microextraction-gas chromatography/mass spectrometry，SPME-GC/MS)分析了竹笋、豆酱、苹果酒等多种食品的风味[2-4]；国内外许多研究者也应用SPME-GC/MS分析了香菇、草菇、白金针菇等多种食用菌的风味物质组成[5-8]。随着嗅闻仪的发明，研究者对食品的风味活性物质进行了大量的研究，固相微萃取结合气相-嗅闻(solid phase microextraction-gas chromatography/olfactometry，SPME/GC-O)也是近年来发展的一种新型的检测特征风味物质的方法，在茶和果汁饮料的特征风味物质的检测上得到广泛应用[9-10]。

食用菌是一种药食同源的食品原料，其营养丰富，风味独特。蛋白质的必需氨基酸组成全面，可以与牛奶相媲美[11]；同时含有多种生物活性物质，具有调整人体生理功能、提高免疫力、抗肿瘤、降血脂、降血压的能力，从而使人体恢复生理平衡,大大提高人体抗病力和活力[12-13]；食用菌的特征风味物质以C8类的不饱和醇、醛、酮类为主，如1-辛烯-3- 醇、1-辛烯-3-酮、辛烯醛等[14-15]。双孢蘑菇是一种成功培育多年，世界上消费范围广泛的食用菌品种，由于它风味独特、营养丰富，有很高的营养价值和经济价值，广泛受到人们的喜爱。因此，双孢蘑菇常被用来生产各种风味产品，如蘑菇罐头、蘑菇汤、蘑菇调味料、蘑菇馅饼等。但是新鲜的双孢蘑菇货架期很短，容易腐烂、变色，这大大影响了其食用价值和经济价值，因此，开发新的产品，增强深加工力度是提高其经济价值的必然途径。蘑菇汤是一种餐桌上的常见菜肴，国外的蘑菇汤类产品比较丰富，也有关于蘑菇汤的相关研究[16]。本研究以双孢蘑菇为原料，经过熬制成蘑菇汤后，利用不同的萃取方法、分离方法对蘑菇汤风味成分进行萃取、分离，最终检测得到菌汤的风味成分，旨在找到适合于菌汤风味萃取及分离的方法，从而确定蘑菇汤的风味活性成分，为双孢蘑菇的精深加工及应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与方法

双孢蘑菇 上海大山生物科技有限公司。

75μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS 萃取头 美国Supelco公司；7890-5975气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；Sniffer9000嗅闻装置 瑞士Brechbuhler公司。

1.2 方法

1.2.1 双孢蘑菇汤的制备

将双孢蘑菇粉与蒸馏水按1:40(m/m)的比例混合，室温浸泡30min，急火煮沸，慢火熬制1h，冷却，8000r/min离心分离的上清液，即双孢蘑菇汤。

1.2.2 风味物质的萃取

采用HS-SPME对挥发性风味成分进行萃取。分别用两种萃取头——75μm CAR/PDMS和50/30μm DVB/CAR/PDMS对样品进行萃取，在15mL装有磁力搅拌子的顶空采样瓶中装入双孢蘑菇汤5mL、NaCl 1.6g，于55℃恒温水浴中边搅拌边萃取30min，于GC进样口250℃解析10min，利用GC-MS分析。

1.2.3 风味化合物的分离与鉴定

用气相色谱-质谱联用仪对风味化合物进行分离鉴定，样品分别通过DB-WAX毛细管柱(30m×0.25mm，0.25μm)及HP-5(30m×0.25mm，0.25μm)毛细管柱进行分离；程序升温条件为40℃保持3min，以5℃/min的速度升到80℃，再以10℃/min的速度升至230℃，在230℃保持7min；载气He；流速1mL/min。质谱条件：EI电离源；电子能量70eV；离子源温度230℃；扫描范围30～550u。

1.2.4 风味化合物的风味特征描述

通过嗅闻装置对风味化合物的风味特征及风味强度进行测定。嗅闻实验前，对评价员进行培训，选出5名评价员，在Sniffer出口进行嗅闻，记录风味特征和强度，对3名以上评价员结论一致的风味方能确认。

1.2.5 风味化合物的定性与定量

化合物的保留指数(retention index，RI)通过正构烷烃(C8～C26)计算得到，未知化合物通过与标准化合物比较RI、文献中相同化合物的RI，NIST 08.L Database或风味描述比较得到；定量分析采用面积归一化法进行。

2 结果与分析

目前，固相微萃取头分为非极性头、极性头及极性/非极性头，研究表明极性/非极性头萃取得到的风味物质更全面[17]。经过CAR/PDMS、DVB/CAR/PDMS两种萃取头萃取后，经GC-MS分析得到的风味物质及相对含量见表1。可以看出，三相萃取头得到的风味化合物为36种，而两相萃取头得到29种风味化合物，其主要区别在于三相萃取头萃取得到的杂原子化合物比较多，如二甲基二硫化物、2,5-二甲基吡嗪、2-乙酰噻唑及2-乙酰吡咯等，这些化合物多为热加工过程中美拉德反应的产物[18]，且其阈值相对较低，对风味的贡献较大，说明三相萃取头对这些物质的萃取效果更好。同时可以看出，双孢蘑菇汤的风味物质主要包括醇类、醛类、酮类、呋喃类及吡嗪类。文献报道，新鲜双孢蘑菇的风味化合物主要由C8类不饱和醇、醛、酮类及苯乙醛组成，其中，C8类不饱和醇、醛、酮类主要是蘑菇中不饱和脂肪酸分解产生的，如亚油酸、亚麻酸[19]。而经过熬制后的蘑菇汤中产生了许多小分子的醛类、酮类，这些化合物主要是在加热过程中许多风味前体物质，如氨基酸、可溶性糖等发生了不同程度的降解产生的，如苯乙醛是苯丙氨酸在加热过程中的降解产物[19]。同时，加热过程促进了美拉德反应的进行，形成了许多美拉德反应产物，如呋喃类、呋喃酮类及吡嗪类等。

表1 不同萃取头萃取得到的风味物质及相对含量Table 1 Flavor compounds and their relative contents in button mushroom extracted by different fibers (DB-WAX)

风味物质经过弱极性柱(HP-5)分离后，分别进入质谱检测器和嗅闻仪，嗅闻员记录风味特征及其风味强度，结果如表2所示。

表2 弱极性柱分离得到的蘑菇汤风味活性化合物及风味特征描述Table 2 Flavor compounds in button mushroom separated by weakpolar column and their characteristic description

从表2可看出，蘑菇汤的风味主要以青草味、巧克力味、蘑菇味、烤香、花香、可可味、熟蘑菇味、麦香、甜香等风味特征为主。这些风味主要是由醛类、醇类、吡嗪类及未知物质等释放出来，这些物质主要来源于蘑菇自身的风味物质的释放及在菌汤熬制过程中风味前体物质的降解及相互间的化学反应引起，主要是由蛋白质、氨基酸及糖类的降解及蛋白质、小肽、氨基酸与还原糖间的美拉德反应产生。其中，醛类中苯甲醛(22.11%)和苯乙醛(3.79%)的相对含量较高，而苯乙醛的风味强度明显高于苯甲醛，说明苯乙醛的阈值要低于苯甲醛；其次，正己醛(1.86%)的青草味也较强；蘑菇味的1-辛烯-3-醇是食用菌类的特征风味，虽然相对含量(0.87%)较低但仍然呈现出较强的风味；虽然通过嗅闻仪闻到很强的熟蘑菇味，但未能在GC-MS上检测出来，说明非极性柱对这种物质的分离效果不太好。大量吡嗪类的化合物被检测出来，同时，这些物质通过嗅闻仪闻到了不同强度的风味，主要是2,6-二甲基吡嗪的巧克力味、2-乙基-5-甲基吡嗪的烤香、2-乙烯基-6-甲基吡嗪的可可味、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪的烤香和可可味及2,5-二甲基-3-(3-甲基丁基)吡嗪的烤香味，这与Misharina等[20]的研究结果是一致的。这些吡嗪类化合物的相对含量相对较低而风味强度却相对较高，说明他们的阈值都比较低，对蘑菇汤的风味有很大的贡献。

表3 极性柱分离得到的蘑菇汤风味活性物质及风味特征描述Table 3 Flavor compounds in button mushroom separated by polar column and their characteristic description

从表3可看出，通过DB-WAX分离得到的风味化合物与HP-5分离得到的风味化合物有一定区别。最大的区别在于通过DB-WAX分离后嗅闻到的蘑菇味和熟蘑菇味的次数明显增多，对应检测到的化合物主要是含8个碳原子的不饱和醇、醛、酮类，如1-辛烯-3-酮、2-辛烯-1-醇、3-辛烯-2-酮等，这些化合物都未在HP-5上分离到，同时，正辛醛、正辛醇等化合物也是HP-5柱上未分离到的。在DB-WAX柱分离后，嗅闻到强烈的花香味(苯乙醛)及果香味(3-甲基丁醛)，这些芳香醛和小分子的醛类可能是由于美拉德反应产生的[19,21]。同时闻到了酸奶味(未知)及肉香味(2-乙酰噻唑)，这些风味物质可能是蘑菇在熬制过程中的美拉德反应的产物，由于这些物质的存在使蘑菇汤的风味独特。而DB-WAX柱分离得到的吡嗪类化合物相对HP-5得到的较少，未闻到烤香味和可可味，这说明DB-WAX柱分离吡嗪类化合物的效果比HP-5差，但它得到的蘑菇风味的特征化合物明显多于HP-5。综合来看，DB-WAX柱更适合于蘑菇汤风味物质的分离。

3 结 论

3.1 通过对两种萃取头效果的比较，DVB/CAR/PDMS萃取得到的风味物质多于CAR/PDMS；DVB/CAR/PDMS萃取头不仅萃取到多种蘑菇类的风味活性物质，而且萃取到多种美拉德反应产生的风味化合物。因此，DVB/CAR/PDMS萃取头更适合于双孢蘑菇汤风味物质的萃取。

3.2 利用两种不同极性的色谱柱对蘑菇汤风味化合物进行分离，结合质谱及嗅闻仪鉴定风味组成、风味特征及风味强度，结果显示，不同极性的色谱柱分离得到的风味化合物差异较大，非极性柱得到的吡嗪类化合物相对较多，而只得到一种蘑菇类风味活性物质；极性柱虽然得到的吡嗪类化合物相对较少，但得到多种蘑菇风味活性物质，同时得到果香味(斯特雷克降解得到的醛)、烤香味及肉香味(杂原子化合物)等多种美拉德反应产生的风味活性物质。说明极性柱(DB-WAX)更适合于双孢蘑菇汤风味物质的分离。

3.3 通过HS-SPME-GC-MS-O分析，得到双孢蘑菇汤的风味活性物质主要是呈现蘑菇味的1-辛烯-3-酮、3-辛烯-2-酮、1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇，呈现果香的3-甲基丁醛，青草味的正己醛，爆米花味的2,5-二甲基吡嗪、巧克力风味的2,6-二甲基吡嗪、花香味的苯乙醛及肉香味的2-乙酰噻唑等。

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Analysis of Flavor Components in Button Mushroom Soup by HS-SPME-GC-MS and GC-O

LI Qin，ZHU Ke-xue，ZHOU Hui-ming*
(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In order to clarify the contribution of flavor components to the overall flavor of button mushroom (Agaricus bisporus),the flavor compounds in mushroom were analyzed by headspace-solid phase microextraction (HS-SPME) combined with gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactometry (GC-O). Two kinds of SPME fibers with different coatings and two columns with different polarities were used for the extraction and separation of flavor compounds.The results indicated that the SPME fiber (DVB/CAR/PDMS) with three phases could separate more flavor compounds than the fiber (CAR/PDMS) with two phases; similarly, the polar column (DB-WAX) could separate more flavor compounds than the weak-polar column (HP-5), especially octane and octene derivatives. Nevertheless, more pyrazine compounds could be separated by non-polar column (HP-5). The major flavor compounds in button mushroom were 1-octen-3-one (mushroom-like flavor), 1-octen-3-ol (mushroom-like flavor), 3-octen-2-one (cooked mushroom-like flavor), benzeneacetaldehyde (floral flavor),2,5-dimethyl pyrazine (popcorn flavor), 2,6-dimethyl pyrazine (roasted nut flavor), hexanal (grass flavor), 3-methylbutanal(fruity flavor) and 2-acetylthiazole (meat flavor).

button mushroom (Agaricus bisporus)；flavor compounds；headspace-solid phase microextraction (HSSPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)；gas chromatography-olfactometry (GC-O)；polar column；weak-polar column

TS255.5

A

1002-6630(2011)16-0300-05

2010-10-31

“十一五”国家科技支撑计划项目(2008BADA1B05)

李琴(1982—)，女，博士研究生，研究方向为方便食品及品质改良。E-mail：liqin200809.funny@163.com

*通信作者：周惠明(1957—)，男，教授，博士，研究方向为方便食品及品质改良。E-mail：hmzhou@jiangnan.edu.cn