猪乙脑RT-PCR快速诊断方法的建立

冯永胜 江 科 衣服德 （山东省青岛市畜牧兽医研究所 266100）

流行性乙型脑炎，简称乙脑，是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis Virus，JEV)引起，是典型的人畜共患病之一。猪是JEV最重要的自然宿主，可引起母猪流产、公猪睾丸急性炎症或不育等。病毒通常在蚊—猪一蚊等动物间循环，JEV在猪群的长时间贮存与循环传播可促进JEV的变异，增加环境中JEV的浓度，而使人感染JEV的几率升高。其他动物包括人在内，大都呈现隐性感染，病毒血症期短。近几十年，许多学者从流产的死胎、公猪睾丸及蚊虫体内分离到该病毒。因此，研究猪源JEV的流行病学，建立JEV快速诊断技术，对养猪业与公共卫生均具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 引物设计 参照乙脑病毒SA14-14-2毒株的基因组序列，采用Primer5.0引物设计软件，设计1对乙脑病毒特异性引物，引物序列为：P1：5＇-ATCCTGGCTATGCTTT CCT-3＇，P2：5＇-CTCTGTTTCTCCACGCTGT-3＇，扩增产物的长度为819bp。

1.2 乙脑病毒RNA提取 取250μl经反复冻融的乙脑病毒细胞培养液，加750μl Trizol裂解液，充分震荡，静置5 min后加200μl氯仿，彻底混匀，4℃，10000rpm 15min，取上清。加入等体积的异丙醇，混匀，-20℃，30min或15min后，12000rpm，10min。倒掉上清，1ml75%的DEPC乙醇洗涤沉淀，4℃，12000rpm 5min，其上清，凉干。加入10μlDEPC水溶解，-80℃保存备用。

1.3 RT-PCR特异性检验 使用相同的引物在相同条件下扩增乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，以检验建立的RT-PCR的特异性。按照大连宝生物(TaKaRa公司)RT-PCR试剂盒操作说明，RT-PCR反应条件：50℃反转录30min，94℃预变性2min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，72℃延伸10min。PCR结束后，扩增的特异性片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 RT-PCR灵敏性检验 将培养的乙脑病毒培养液作依次作10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释，高速离心后取上清，提取RNA进行RT-PCR，电泳检查结果。

1.5 RT-PCR临床应用 建立猪流行性乙型脑炎病毒的RT-PCR检测技术后，从临床上采集67份病猪疑似样品(心、肝、肺、淋巴结和脑组织)和53份蚊虫样品，进行RT-PCR扩增，检测猪流行性乙型脑炎病毒。

2 结果

2.1 RT-PCR特异性 利用合成的引物对乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)进行RT-PCR扩增，结果仅JEV能扩增出819bp大小的特异性片段，其它两种病毒未扩增出片段(图1)，证实了建立的RT-PCR对乙型脑炎病毒具有较高的特异性。

图1 乙型脑炎病毒RT-PCR特异性测定

2.2 RT-PCR灵敏性 将病毒培养液作依次作10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释，然后进行RT-PCR扩增。结果显示，10-3、10-4、10-5和10-6稀释浓度RT-PCR扩增结果均为阳性，但DNA条带亮度逐渐降低，10-7稀释度RT-PCR扩增结果为阴性。根据cDNA模板的原始浓度推算，检测JEV的RT-PCR的最小灵敏度能够达到纳克(ng)级别。

2.3 RT-PCR临床应用效果 运用建立的RT-PCR检测技术，从67份临床病猪样品中检测出8份乙脑病毒阳性样品，阳性率为11.9%；从53份猪场周围收集的蚊虫样品中检测出2份乙脑病毒阳性样品，阳性率为3.8%。建立猪乙型脑炎病毒快速诊断技术通过进行RT-PCR特异性检验、RT-PCR灵敏性检验和RT-PCR临床应用等工作，证明对乙型脑炎病毒具有较高的特异性，根据cDNA模板的原始浓度推算，检测JEV的RT-PCR的最小灵敏度能够达到纳克(ng)级别。临床应用效果良好。

3 结论

建立猪流行性乙型脑炎(JEV)快速诊断技术，用于猪流行性乙型脑炎的流行病学分析。运用自行设计的特异性引物和RT-PCR技术，能够在6h内准确判定JEV，具有灵敏、准确、快速的特点。