哈蟆油水溶性总蛋白抗疲劳活性的研究

张 梅，赵 雨，*，李芸彤，幺宝金，曲晓波

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117;2.吉林大学公共卫生学院，吉林长春130021)

哈蟆油水溶性总蛋白抗疲劳活性的研究

张 梅1，赵 雨1，*，李芸彤1，幺宝金2，曲晓波1

(1.长春中医药大学中医药与生物工程研发中心，吉林长春130117;2.吉林大学公共卫生学院，吉林长春130021)

研究了哈蟆油水溶性总蛋白的抗疲劳药理活性。采用中性缓冲液浸提，硫酸铵沉淀法制备哈蟆油水溶性总蛋白。设立哈蟆油水溶性总蛋白低、中、高三个剂量组(0.075、0.15、0.30g/kg)，同时设立空白对照组，小鼠灌胃给药30d。观察小鼠体重、负重游泳时间、尿素氮含量、肝糖原含量、血乳酸含量等指标的变化。实验结果表明，哈蟆油水溶性总蛋白可延长小鼠负重游泳时间，降低血清尿素氮含量，显著增加肝糖原含量，显著降低血乳酸含量，对小鼠的体重无明显影响。证明了哈蟆油水溶性总蛋白具有一定的抗疲劳作用。

哈蟆油，水溶性总蛋白，抗疲劳

哈蟆油(Oviductus Ranae) ，为中国林蛙雌蛙的输卵管，具有益精补肾、滋阴养颜、延缓衰老、增强人体免疫力之功效，临床上用于阴虚体弱，神疲乏力，咳嗽咳血等症［1－2］。1940 年寿田 文 次郎等日本学者［3］，对产于吉林的哈蟆油进行了化学成分研究，结果表明哈蟆油的成分主要为蛋白质。90年代，范玉林［4］等对哈蟆油蛋白进行了进一步测定，结果表明哈蟆油中总蛋白含量为48.51%～51.23%，其中水溶性蛋白含量为13.33%。目前，哈蟆油的药理研究主要以整体药材为研究对象，对其主要成分蛋白质的药理研究未见报道。本研究选取从哈蟆油中分离提取得到的水溶性总蛋白，就其抗疲劳生物活性进行了探讨，为哈蟆油系列产品研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

哈蟆油 购于吉林省白山市北亚药业，经长春中医药大学中药鉴定教研室姜大成教授鉴定为中国林蛙(Rana temporaria chensinensisDavid)雌蛙的干燥输卵管;SPF级BALB/C种雄性小鼠 体重为(20±2)g，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供;磷酸氢二钠、二乙酰肟、蒽酮 均为国产分析纯。

中空纤维膜过滤系统 GE Healthcare;722N型分光光度计 上海尤尼柯有限公司;DS－1型组织匀浆器 上海正慧工贸有限公司;HH.S21－8－S型恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂;TDL－5－A型离心机 上海安亭科学仪器厂;LL3000型冷冻干燥机 德国Heto公司;游泳箱 50cm×40cm×35cm。

1.2 实验方法

1.2.1 哈蟆油水溶性总蛋白的制备［5］pH为6.5的20mmol/L磷酸－磷酸氢二钠缓冲溶液(含0.5mol/L的氯化钠)，在料液比1∶200的条件下浸提3次，4500r/min离心20min，取其上清，经中空纤维膜过滤澄清(0.45μm)，80% 硫酸铵沉淀，4500r/min离心20min，取其沉淀透析 24h，4500r/min 离心 20min，取其上清，真空冷冻干燥，冻干品即为水溶性总蛋白，蛋白收率为 9.96%，folin－酚法测定蛋白纯度为86%。

1.2.2 动物分组与给药剂量 小鼠随机分为4组:空白对照组(同体积蒸馏水)、哈蟆油水溶性总蛋白(低、中、高)3个剂量组，灌胃剂量分别为0.075、0.15、0.30g/kg，相当于人体剂量的 2.5、5、10 倍。每天灌胃一次，连续30d。灌胃期间饲喂合成鼠料，自由摄食、饮水，温度(22±1)℃。

1.2.3 体重及负重游泳实验 测量小鼠实验前、实验中(4d/次)及实验终期的体重。末次给予受试样品30min后，将尾根部负荷5%体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深约30cm，水温(25±1)℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即为小鼠负重游泳时间。

1.2.4 血清尿素氮测定 末次给予受试样品30min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后立即拔眼球采血0.5mL(不加抗凝剂)，置4℃冰箱约3h，血凝固后2000r/min离心15min，取血清50μL，采用二乙酰－肟法［6］测定血清尿素氮含量。

1.2.5 肝糖原测定 末次给予受试样品30min后处死小鼠，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏 100mg，加 8mL三氯醋酸，匀浆 1min，3000r/min离心15min，取上清液用蒽酮法［6］测定肝糖原含量。

1.2.6 血乳酸测定 末次给予受试样品30min后，从内眦静脉丛采血20μL，然后不负重在30℃的水中游泳10min后停止，分别于运动后0、20min同上采血20μL，测定血乳酸含量［6］。计算血乳酸曲线下面积，血乳酸曲线下面积=5×(游泳前血乳酸值+3×游泳后0min的血乳酸值+2×游泳后休息20min的血乳酸值)。

1.2.7 统计学处理与结果判定 采用SPSS13.0软件，通过单因素方差分析进行统计学处理。实验结果表示为±s，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异非常显著。

2 结果与分析

2.1 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠体重的影响

哈蟆油水溶性总蛋白各剂量组小鼠实验初始、中期、终末的体重与对照组相比，均无显著性差异(P＞0.05)。

2.2 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠负重游泳时间及血清尿素氮含量的影响

由表1可见，哈蟆油水溶性总蛋白各实验组负重游泳时间均比对照组延长，但均无显著性差异(P＞0.05)。各剂量组血清尿素氮含量均比对照组降低，但均无显著性差异(P＞0.05)。表明哈蟆油水溶性总蛋白延长小鼠负重游泳时间和降低小鼠尿素氮含量的作用不显著。

表1 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠负重游泳时间及血清尿素氮含量的影响(n=15±s)

表1 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠负重游泳时间及血清尿素氮含量的影响(n=15±s)

组别 游泳时间(min)血清尿素氮(BUN)(mmol/L)空白对照组13.4±3.4 11.3±0.52 8.0±2.5 11.9±0.78低剂量组 9.4±3.1 11.7±0.56中剂量组 10.6±3.2 11.7±0.49高剂量组

2.3 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠肝糖原含量的影响

由表2可见，哈蟆油水溶性总蛋白各剂量组肝糖原含量均比对照组升高，且低、中剂量组具有显著性差异(P＜0.05)。表明哈蟆油水溶性总蛋白能显著增加小鼠运动后肝糖原储备量。

表2 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠肝糖原含量的影响(n=15±s)

表2 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠肝糖原含量的影响(n=15±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05。

组别 肝糖原含量(mg/100g肝)空白对照组4792.82±202.50低剂量组 596.51±193.24*中剂量组 5632.08±191.19*高剂量组4870.53±196.71

2.4 哈蟆油水溶性总蛋白对血乳酸含量的影响

由表3可见，小鼠游泳前，哈蟆油水溶性总蛋白实验组各剂量组血乳酸值与对照组比较明显降低，差异非常显著(P＜0.01);游泳10min后，各剂量组血乳酸值均比对照组降低，但无显著性差异(P＞0.05);游泳10min休息20min后，各剂量组血乳酸值与对照组比较明显降低，且低剂量组差异显著(P＜0.05)，中、高剂量组差异非常显著(P＜0.01);各剂量组的乳酸曲线下面积与对照组相比明显降低，且低剂量组差异显著(P＜0.05)，中、高剂量组差异非常显著(P＜0.01)。结果表明，哈蟆油水溶性总蛋白能显著降低小鼠血乳酸的含量。

3 讨论

在长时间较大强度运动时，血清尿素氮的变化范围明显，血清尿素氮与机体机能、疲劳程度以及负荷量的大小呈密切正相关关系，可用来作为评定运动量的指标［7］。一旦肝糖原耗竭引起血糖水平下降而使运动肌供能不足，将导致外周疲劳，同时由于体内糖贮量下降或过度消耗，血糖浓度下降，中枢系统能量供应受影响，产生中枢疲劳，所以肝糖原贮量对维持长时间运动时血糖浓度起重要作用［8］。减少乳酸的产生或加快乳酸的消除，都可延缓疲劳发生或加速疲劳的消除，血乳酸水平可以反映有氧代谢能力、疲劳的产生和消除速度［9］。

表3 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠血乳酸含量的影响(n=15±s)

表3 哈蟆油水溶性总蛋白对小鼠血乳酸含量的影响(n=15±s)

注:与空白对照组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

血乳酸曲线下面积空白对照组别 全血LAC含量(mmol/L)泳前 泳后0min 泳后20min＊＊2.49±1.06 1.63±0.73 1.13±0.46 48.11±18.79低剂量组 1.05±0.43＊＊ 1.20±0.41 0.75±0.27* 31.01±9.18*中剂量组 0.89±0.40＊＊ 1.35±0.47 0.67±0.28＊＊ 31.58±9.51＊＊高剂量组 1.46±0.44＊＊ 1.23±0.43 0.72±0.24＊＊ 33.06±9.96

本研究首先通过负重游泳持续时间直接观察到了哈蟆油水溶性总蛋白能延长小鼠的游泳时间，然后通过测定尿素氮、肝糖元和血乳酸相关的生化指标，研究了哈蟆油水溶性总蛋白的抗疲劳作用。结果表明:低、中剂量组小鼠肝糖原含量明显高于对照组，具有增强机体肝糖原储备的作用;各剂量组小鼠运动后的血乳酸曲线下面积均小于对照组，具有延缓疲劳发生或加速疲劳消除的作用;各剂量组降低小鼠运动后血清尿素氮含量的作用不明显。证明哈蟆油水溶性总蛋白具有一定的抗疲劳作用，本研究为进一步开发利用哈蟆油水溶性总蛋白奠定了基础。

［1］刘玉兰，牟孝硕，崔素玉.蛤蟆油的抗衰老作用［J］.沈阳药科大学学报，1998，15(1):56.

［2］刘玉兰，姜云梅，尤越人.蛤蟆油及其提取物对肾虚和正常小鼠的抗疲劳作用［J］.沈阳药科大学学报，1997，14(1):20.

［3］Jiu BTQG.About oviductas ranae research on oviductas ranae oral［J］.Japanese Med Anal，1934，18:39.

［4］范玉林，崔香顺，姚玉霞.哈士蟆油成分研究的进展［J］.吉林农业大学学报，1996，18(3):105－107.

［5］刘思超，赵雨，张梅，等.哈蟆油总蛋白提取工艺［J］.食品研究与开发，2009，30:19－21.

［6］保健食品检验与评价技术规范［S］.2003:87－93.

［7］刘育京.中国医学百科伞书.消毒、杀虫、灭鼠［M］.上海:科学技术出版社，1982.

［8］魏守刚，孙廷莹.糖与耐力运动［J］.山东体育科技，1996，69(18):58－60.

［9］张肃，胡春晓，金莉莉，等.东北林蛙卵蛋白抗疲劳活性研究［J］.特产研究，2010，47(1):7－9.

Study on the anti－fatigue function of water－miscible total proteins from Oviductus Ranae

ZHANG Mei1，ZHAO Yu1，*，LI Yun－tong1，YAO Bao－jin2，QU Xiao－bo1

(1.Center for New Medicine Research of Changchun University of Traditional Chinese Medicine，Changchun 130117，China;2.School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China)

The pharmacological activity of water－miscible total proteins from Oviduetus Ranae was studied.Prepared water－miscible total proteins by neutral buffer extraction and ammonium sulfate precipitation.Low，medium，high(0.075，0.15，0.30g/kg)dose of water－miscible total proteins and a blank dose had been applied to mice for 30d continuously.The change of body weight of mice，swimming time，urea nitrogen，hepatic glycogen，and blood lactic acid content were observed.The results showed that the water－miscible total proteins of Oviductus Ranae could extend the swimming time of mice，significantly increase liver glycogen contents，significantly lower blood lactate levels，and had no significant effect on body weight of mice.The results proved the water－miscible total proteins of Oviductus Ranae had anti－fatigue effect.

Oviductus Ranae;water－miscible total proteins;anti－fatigue

TS201.4

A

1002－0306(2011)11－0417－03

2010－11－15 *通讯联系人

张梅(1985－)，女，硕士研究生，研究方向:蛋白质的结构功能研究及产品开发。

国家“十一五”科技支撑项目(2007BAI38B06)。