响应面分析法优化抑制-褪色光度法测定维生素C的条件

王巧英，吴冬青，安红钢，宋 海，任雪峰

(河西学院化学系，甘肃张掖 734000)

响应面分析法优化抑制-褪色光度法测定维生素C的条件

王巧英，吴冬青，安红钢，宋 海，任雪峰*

(河西学院化学系，甘肃张掖 734000)

基于维生素C对罗丹明B和K2S2O8间经Ag+催化的褪色反应的抑制作用，研究响应面分析法优化抑制－褪色光度法测定维生素C的条件。在RB的用量、HAc的用量、反应温度和反应时间四个单因素实验基础上，通过响应面法优化抑制－褪色光度法测定维生素C的条件，利用Box－Behnken设计模型，研究四个自变量对该反应的影响。结果表明:该反应的最佳条件为，RB的用量6.99mL，HAc的用量2.81mL，温度为20℃，反应时间11.82min。在此条件下，测得土泡参中VC含量为0.08mg/g。该方法精密度好，RSD(n=5)为0.25%，回收率高，平均回收率为100.97%。

响应面法，抑制褪色，VC，条件实验

抗坏血酸(VC)具有较好的还原性，可用于延长食品保质期和调节口味，提高人类、鱼类的抗病以及皮肤的抗衰老能力［1］。近年来已经报道的测定维生素C的方法有∶滴定法、分光光度法、荧光分光光度法、毛细管电泳法、原子吸收法、近红外法、高效液相色谱法［2］、电化学法、碘量法、酶法［3］等。这些方法表现出灵敏度较低、仪器复杂、操作繁琐的缺点［4］。实验基于维生素C对罗丹明B和K2S2O8间经Ag+催化的褪色反应的抑制作用，研究响应面分析法优化抑制－褪色光度法测定维生素C的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

土泡参 采自甘肃省陇西，将土泡参先经自来水、蒸馏水清净，烘干至恒重，粉碎过60目筛，备用; VC标准溶液 1.20×10－2g/L;Ag(I)溶液 AgNO3(分析纯)先配成1.000g/L贮备液，临用时再稀释至0.8006mg/L;过硫酸钾溶液 1.00×10－3mol/L;罗丹明B(RB)溶液 1.00×10－5mol/L;HAc溶液1.00mol/L;试剂 为分析纯;实验用水 均为蒸馏水;所用仪器 均经自来水、蒸馏水清洗备用。

WFJ－2100型分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;Lambda系列紫外/可见分光光度计 美国PerkinElmer公司;GB204电子天平 梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;DK－98－Ⅱ型电热恒温水浴锅

天津市泰斯特仪器有限公司;YLD－2100电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司。

1.2 实验方法

取25mL容量瓶，加2.00mL RB，1.00mL HAc，4.00mL K2S2O8，2.00mL Ag(I)，混匀，再加0.10mL VC标准溶液，以水定容，于(50±0.2)℃恒温水浴锅中保持10min，取出流水冷却至室温，用1cm比色皿于556nm处，以水作参比，测量试剂空白的吸光度(A0)及试剂的吸光度(Ai)。ΔA=Ai－A［4］0。

1.2.1 测定波长的选择 取25mL容量瓶，加2.00mL RB，1.00mL HAc，4.00mL K2S2O8，2.00mL1.000g/L Ag(I)，混匀，再加入0.10mL VC标准溶液，以水定容，于(50±0.2)℃恒温水浴锅中保持10min，取出流水冷却至室温，以不加标准溶液的相应溶液为空白，在波长400～600nm进行缩小范围的连续波长扫描。结果表明在波长556nm处有最大吸收，因此选择556nm为测定波长。

1.2.2 单因素实验 按照实验方法，分别以RB的用量、HAc的用量、反应温度和反应时间为影响因素，设置四个因素的不同水平，来确定相关因素对抑制－褪色光度法测定维生素C的影响。

1.2.3 响应面实验［5－8］在单因素实验的基础上，根据Box－Behnken的中心组合实验设计原理，选取RB的用量、HAc的用量、反应温度和反应时间为实验因素，以溶液的吸光度为实验指标，设计了四因素三水平的响应面分析实验，其水平编码表见表1。

表1 响应面法实验的因素水平编码

1.2.4 VC含量的测定

1.2.4.1 标准曲线的绘制 取25mL容量瓶，加7.00mL RB，2.80mL HAc，4.00mL K2S2O8，2.00mL 0.8006mg/L Ag(I)，混匀，再分别加入 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50mL VC标准溶液，以水定容，于(20±0.2)℃恒温水浴锅中保持11.80min，取出流水冷却至室温，以蒸馏水为试剂空白，在波长556nm处测定吸光度值，作VC含量测定的标准曲线。

1.2.4.2 土泡参溶液的配制 根据本课题组之前所做工作，称取1.0003g土泡参置于圆底烧瓶中，按1∶30料液比，加入30mL的蒸馏水，在35℃的水浴中回流三次，抽滤。最后将滤液用蒸馏水定容到100mL的容量瓶中，摇匀。

1.2.4.3 精密度实验 按照实验方法，选择响应面设计的最佳反应条件，加入各种试剂，然后再取土泡参溶液4.00mL，测量吸光度值，平行测5次，根据标准曲线，计算精密度。

1.2.4.4 回收率实验 按照实验方法，选择响应面设计的最佳反应条件，加入各种试剂于5个25mL容量瓶中，然后分别加入土泡参溶液4.00mL，最后分别加入VC标准溶液0.50、1.00、1.50、2.00、2.50mL，测量吸光度，由标准曲线方程可得相应的VC的含量，进而求出对应的理论的VC含量，计算VC回收率。

1.2.4.5 样品分析 按照精密度实验的步骤，测量相应吸光度，根据标准曲线，计算出土泡参中总的VC质量，再由以下公式计算出VC在土泡参样品中的百分含量∶

2 结果与结论

2.1 吸收曲线和测定波长的确定

按照实验方法绘制吸收光谱。图1表明∶各条曲线于556nm处均有最大吸收峰，因此选择λ= 556nm作为VC的测量波长。

图1 吸收光谱

2.2 单因素实验结果［8］

2.2.1 罗丹明B的用量对抑制－褪色反应的影响固定HAc的用量1.00mL，反应温度50℃，反应时间10min，考察RB的用量对吸光度的影响。由图2可看出，在其它条件不变情况下，随RB的用量增大，对应的吸光度也随之增大。当 RB的用量在1.00～5.50mL的范围内时，吸光度均小于0.20，当RB的用量在6.00mL时，吸光度大于0.20，符合测定吸光度条件。综合各种因素，选择RB的用量为6.00mL。

图2 罗丹明B的用量对抑制－褪色反应的影响

2.2.2 HAc的用量对抑制－褪色反应的影响 固定RB的用量6.00mL，反应温度50℃，反应时间10min，考察HAc的用量对吸光度的影响。图3结果显示，影响抑制－褪色反应的最佳HAc的用量为3.00mL。

图3 HAc的用量对抑制－褪色反应的影响

2.2.3 反应温度对抑制－褪色反应的影响 固定RB的用量 6.00mL，HAc的用量 3.00mL，反应时间10min，考察反应温度对吸光度的影响。图4结果显示，影响抑制－褪色反应的最佳反应温度为25℃。

2.2.4 反应时间对抑制－褪色反应的影响 固定RB的用量6.00mL，HAc的用量3.00mL，反应温度为25℃，考察反应时间对吸光度的影响。图5结果显示，影响抑制－褪色反应的最佳反应时间为11min。

2.3 响应面优化设计与结果

按照Box－Behnken中心组合实验方案进行了四因素三水平实验，以吸光度值为指标，研究各因素间相互作用下的吸光度值，实验结果见表2。表2中1～24为析因实验，25～29为中心实验。29个实验点分为析因点和零点，其中析因点为自变量取值在X1、X2、X3、X4所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点实验重复5次，用来估计实验误差［5］。

表3 回归方程方差分析

图4 反应温度对抑制－褪色反应的影响

图5 反应时间对抑制－褪色反应的影响

2.4 响应面分析与优化

采用Design－expert 7.1.6软件对表2中数据进行多项式拟合回归，建立多元二次响应面回归模型∶

因素的ANOVA分析结果见表3。

由表3可看出，模型的“Prob＞F”值小于0.0001，表明二次方程拟合极显著，失拟项F值大于0.05，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的。决定系数为R2=0.9889，也说明回归方程的拟合程度很好，失拟较小。从表3中的P值可知，方程中X1、对Y值的影响极显著(P＜0.01)，X1X3、X1X4、对Y值的影响显著(P＜0.05)，表明方程一次项、二次项的影响都是显著的，交互项作用影响也是显著的，这与模拟回归预测吻合。各交互因素响应面图如图6～图9，

表2 响应面设计方案及实验结果

表4 回收率实验结果

图6 RB用量和HAc用量的交互作用

图7 RB用量和反应温度的交互作用

图8 RB用量和反应时间的交互作用

图9 HAc用量和反应时间的交互作用

决定系数R2=0.9889说明模型拟合好，实验误差小，实验操作可信，可用此模型优化抑制－褪色光度法测定维生素C的条件。

通过回归模型预测的抑制－褪色光度法测定维生素C的最佳条件为∶罗丹明B用量6.99mL，HAc用量2.81mL，反应温度20.0℃，反应时间11.82min，在此条件下，吸光度值理论上可达0.285考虑到实际操作的可行性，将抑制－褪色光度法测定维生素C的条件在回归方程得到的理论值基础上修正为∶罗丹明B用量7.00mL，HAc用量2.80mL，反应温度20.00℃，反应时间11.80min，在此条件下进行三次平行实验，实际测得的平均吸光度值为0.286，与实际值相差甚微，说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际价值。

2.5 标准曲线与回归方程

按最佳实验条件，取不同体积VC标准溶液绘制标准曲线，所得标准曲线及线性关系见图10。

图10 VC标准曲线

2.6 土泡参中VC含量测定结果

取三个25mL的容量瓶，根据回归模型预测的抑制－褪色光度法测定维生素C的最佳条件，分别加入各种试剂，然后分别准确加入土泡参溶液4.00mL，测得值为0.286。由标准曲线可得，土泡参溶液中VC的含量为0.08mg/g。

2.7 精密度实验结果

表3 精密度实验结果

2.8 回收率测定结果

3 结论

3.1 在单因素实验的基础上，应用响应面法优化抑制－褪色光度法测定维生素C的实验条件。结果表明∶罗丹明B的用量、HAc用量二次方项、反应时间二次方项对Y值的影响极显著(P＜0.01)，罗丹明B的用量和反应温度、罗丹明B的用量和反应时间的交互作用对Y值的影响显著(P＜0.05)，说明罗丹明B的用量、HAc的用量、反应温度和反应时间在抑制－褪色光度法测定维生素C的实验中不是简单的线性关系。

3.2 回归分析及验证实验结果表明，该方法准确、可行。抑制－褪色光度法测定维生素C的最佳实验条件为∶罗丹明B用量6.99mL，HAc用量2.81mL，反应温度20.0℃，反应时间11.82min。在此条件下，测得土泡参中VC的含量为0.08mg/g。该方法精密度好，RSD(n=5)为 0.25%，回收率高，平均回收率为100.97%。

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Study on optimization of conditions of determination of vitamin C by
inhibition discoloring spectrophotometry using response surface methodolgy

WANG Qiao－ying，WU Dong－qing，AN Hong－gang，SONG Hai，REN Xue－feng*
(Department of Chemistry，Hexi University，Zhangye 734000，China)

Base on the inhibition effect of Vitamin C on discoloring reaction between Rhodamin B and K2S2O8by Ag+catalysis，response surface methodology(RSM)was emplyed to optimize the condition(temperature，time，dosage of RB，dosage of HAc).The result of RSM showed that the optimum condition was as fllows:reaction temperature 20.0℃，reaction time 11.82min，dosage of RB 6.99mL and dosage of HAc 2.81mL.Under these condition，the content of Vitamin C from Tragopogon porrifolius L.is 0.08mg/g.The results showed that recovery of standard addition was 100.97%，and the RSD(n=5)was 0.25%.

RSM;discoloring reaction;Vitamin C;condition test

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0443－05

2010－10－21 *通讯联系人

王巧英(1989－)，女，研究方向:天然产物提取与分离。

甘肃省教育厅(1009－09)科研资助项目。