肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞分选及其生物学特性的研究*

黄 涛, 周 奇， 宫东伟， 高全立， 张旭华, 吕晓东， 周进学

(郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院 1肝胆胰外科，4生物治疗科,5中心实验室，河南 郑州 450000；2中山大学第一附属医院肝胆外科，广东 广州 510080；3新乡医学院第三附属医院普外科，河南 新乡 453003)

肝癌SMMC-7721细胞中侧群细胞分选及其生物学特性的研究*

黄 涛1△, 周 奇2， 宫东伟3， 高全立4， 张旭华5, 吕晓东5， 周进学1

(郑州大学附属肿瘤医院，河南省肿瘤医院1肝胆胰外科，4生物治疗科,5中心实验室，河南 郑州 450000；2中山大学第一附属医院肝胆外科，广东 广州 510080；3新乡医学院第三附属医院普外科，河南 新乡 453003)

目的分选肝癌SMMC-7721细胞中的侧群(SP)细胞并分析其生物学特性。方法采用流式细胞荧光激活分选(FACS)技术将SMMC-7721细胞分为SP细胞和非侧群(NSP)细胞2个亚群。细胞生长曲线法和平板克隆法比较SP细胞和NSP细胞的增殖能力和克隆形成能力；Transwell法检测SP细胞和NSP细胞的迁移及侵袭能力；流式细胞术分析细胞周期及细胞凋亡率；裸鼠体内成瘤实验比较SP细胞和NSP细胞的致瘤性。结果SMMC-7721细胞中分选出的SP细胞比例为(9.2±0.2)%。SP细胞中G0/G1期细胞比例高于NSP细胞，凋亡率低于NSP细胞(P<0.05)；SP细胞的增殖速度、克隆形成能力、体外迁移和侵袭能力均明显高于NSP细胞(P<0.05)；裸鼠成瘤实验显示SP细胞的致瘤能力明显高于NSP细胞。结论肝癌SMMC-7721细胞中的SP细胞可能富集了肝癌干细胞。

肝肿瘤； 侧群细胞； 肿瘤干细胞； SMMC-7721细胞

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是目前死亡率位列第3的恶性肿瘤，具有手术切除率低、术后复发率高及放化疗不敏感等临床特点，探索新的治疗方法是提高HCC患者生存率的关键。肿瘤干细胞理论认为肿瘤是由分化程度不同的细胞构成的，仅少数细胞即肿瘤干细胞有形成肿瘤的能力，是肿瘤耐药及复发的根源[1]。如果利用特异标记找到HCC干细胞并以此为靶点进行治疗，可能有望攻克HCC。侧群(side population, SP)细胞是一种特殊类型的干细胞，因其能将Hoechst 33342排出细胞而呈弱染状态[2]。在缺乏特异标记的情况下，SP细胞分选和分析成为研究HCC干细胞的一种实用而重要的方法。本研究利用SP细胞的弱染特性将其从肝癌SMMC-7721细胞中分选出来，并对其生物学特性进行研究，为肝癌干细胞理论提供实验依据。

材 料 和 方 法

1材料与试剂

人肝癌SMMC-7721细胞来自上海中科院细胞库，保存于河南省肿瘤医院中心实验室。RPMI-1640培养基购自Gibco公司。胎牛血清购自郑州益康公司。胰蛋白酶粉购自郑州宝信公司。碘化丙啶(PI)、维拉帕米(verapamil)、Hoechst33342购自Sigma。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司。Transwell小室购自Corning。Matrigel和FACS AriaⅡ流式细胞仪购自BD。CO2恒温细胞培养箱购自Revco。台式离心机购自Beckman。裸鼠购自中科院动物研究所。

2细胞培养

肝癌SMMC-7721细胞以含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和1×105U/L链霉素的RPMI-1640培养基在37 ℃、饱和湿度、5% CO2孵箱内培养，每3-4 d传代1次。

3流式细胞荧光激活分选

取对数生长期细胞，调整细胞密度至1×109cells/L，实验组加入Hoechst33342至终浓度2.5mg/L，对照组再加入verapamil至终浓度100 mg/L，以拮抗SP细胞外排Hoechst33342的特性。 37 ℃水浴60 min，期间每隔15 min振动混匀细胞1次。用PBS洗涤离心1次，重悬于冰冷的RPMI-1640培养基中，上机检测前加入PI至终浓度1 mg/L。详细操作及SP细胞检测参照文献[3]，在活细胞中收集SP细胞和非SP(NSP)细胞。

4生长曲线绘制及克隆形成能力比较

将前1 d分选的SP细胞和NSP细胞制备成单细胞悬液，分别接种于24孔板中，每孔1×104个细胞。每隔24 h SP细胞和NSP细胞各取3孔进行细胞计数，计算平均值。8 d后以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制SP细胞和NSP细胞的生长曲线。

将分选的SP细胞和NSP细胞分别接种于6孔板，每孔200个细胞，培养14 d后进行Giemsa染色并计数大于50个细胞的克隆，计算克隆形成率(colony fformation efficiency，CFE)，CFE=克隆形成数/接种细胞数×100%。

5Transwell小室迁移侵袭实验

采用带有8 μm微孔聚碳酸酯膜的Transwell小室进行迁移实验。按5×108cells/L的浓度将对数生长期的SP细胞和NSP细胞用无血清RPMI-1640培养基制备成单细胞悬液。上室各孔中加入100 μL细胞悬液，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，孵箱中培养48 h后自24孔板中取出上室，用棉签擦去微孔膜上室面的细胞，然后将小室置于95%乙醇中固定15 min，苏木素染色15 min，于200倍光镜下随机选择5个视野计数穿膜细胞，取平均值。每组实验重复3次。

Transwell小室侵袭实验中按1∶3的比例混合matrigel和无血清RPMI-1640培养基，于上室加入50 μL混合液，37 ℃孵育2 h使其凝固，制成人工基底膜。其它步骤同Transwell迁移实验。

6细胞周期检测

胰酶消化并离心收集前1 d分选出的SP细胞和NSP细胞，预冷PBS洗细胞2次后悬于0.5 mL PBS中。将0.5 mL细胞悬液缓缓滴加入4 mL预冷的75%乙醇中，于4 ℃固定2 h以上。离心收集固定后的细胞，PBS洗细胞1次，加入1 mL PI染色液，室温避光孵育30 min，然后直接上流式细胞仪检测。计数2-3万个细胞，用细胞周期分析软件计算处于G0/G1、S和G2/M期的细胞比例。

7细胞凋亡检测

将前1 d分选的SP细胞和NSP细胞用0.25%胰蛋白酶消化，分别制成单个细胞悬液，然后收集细胞，用PBS 洗涤2 次。将细胞重悬于200 μL 结合缓冲液。加入10 μL Annexin V-FITC 轻轻混匀，避光室温反应15 min。加入300 μL 结合缓冲液和5 μL PI，立即上流式细胞仪检测。用细胞凋亡分析软件计算Annexin V+细胞的比例。

8裸鼠成瘤实验

将裸鼠随机分组，每组6只。将分选的SP细胞和NSP细胞按1×105、1×104和1×103的数量分别注射到裸鼠背部皮下，每3 d观察1次肿瘤形成情况，连续4周。

9统计学处理

结 果

1人肝癌SMMC-7721细胞中SP细胞的分选

SP细胞能排出荧光染料Hoechst33342而呈弱染状态，位于流式图的左下角荧光弱染区。SMMC-7721细胞中SP细胞的比例为(9.2±0.2)%，对照组加verapamil，抑制了细胞转运蛋白的功能，从而改变了SP细胞外排荧光染料的特性，使SP细胞比例减少至(0.0±0.0)%，见图1。用离心管收集分选的SP细胞和NSP细胞备用。

Figure 1. Analysis of side population (SP) cells among SMMC-7721 cells by fluorescence-activated cell sorter (FACS). A: Hoechst 33342; B: Hoechst 33342+ verapamil.

图1流式细胞仪分析SMMC-7721细胞中的SP细胞

2SP细胞和NSP细胞的体外增殖能力和克隆形成能力

SP细胞和NSP细胞的生长曲线显示，SP细胞快速增殖至指数增长期，相对而言非SP细胞增殖异常缓慢，在1周时点尚未达到平台期，见图2。SP细胞和NSP细胞生长速度差异显著(n=3,P<0.05)。

Figure 2. Proliferation curves of SP cells and NSP cells.

图2肝癌SP细胞与NSP细胞生长曲线图

与NSP细胞相比，SP细胞形成的克隆较密集且直径较大，见图3。计算SP细胞的CFE为(35.5±5.6)%，而NSP细胞的CFE为(13.8±4.1)%，二者差异显著(n=3,P<0.05)。

Figure 3. Colony formation assay of SP cells and NSP cells.

图3SP细胞和NSP细胞克隆形成能力的比较

3SP细胞和NSP细胞的体外迁移和侵袭能力

Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示，SP细胞和NSP细胞的迁移和侵袭能力存在明显差异,见图4。Transwell小室迁移实验中SP细胞穿过基底膜的细胞数为(203.6±24.3)个，而NSP细胞仅为(71.5±12.4)个；Transwell小室侵袭实验中SP细胞穿过基底膜的细胞数为(67.6±9.6)个，而NSP细胞仅为(27.6±10.7)个，两组比较均差异显著(n=3,P<0.05)。

4SP细胞和NSP细胞的细胞周期检测

细胞周期分析结果表明，SP细胞中G0/G1期细胞比例为(64.06%±1.21)%， NSP 细胞中G0/G1期细胞比例为(53.14±1.06)%，SP细胞中处于静止期的细胞较NSP细胞多，见图5，差异显著(n=3,P<0.05)。

Figure 4. Invisive ability of SP cells and NSP cells detected by Transwell invation assay. A: SP cells; B: NSP cells.

图4Transwell小室侵袭实验检测SP细胞和NSP细胞的侵袭能力

5SP细胞和NSP细胞的凋亡率检测

细胞凋亡分析结果显示，SP细胞和NSP细胞中Annexin V+细胞比例分别为(15.70±4.92)%和(50.20±7.72)%，两者差异显著(n=3,P<0.05)，见图6。

6裸鼠成瘤实验结果

1×103数量的SP细胞可在4周后形成明显的皮下移植瘤。NSP细胞则至少需1×105才能成瘤。

Figure 5. Cell cycle analysis of SP cells and NSP cells. The left panel shows the result of SP cells and the right one exhibit the result of NSP cells.

图5SP细胞和NSP细胞周期分析结果

Figure 6. Apoptosis detection of SP cells and NSP cells by flow cytometry and Annexin V-FITC/PI.

图6AnnexinV-FITC/PI流式细胞仪检测SP与NSP细胞凋亡

讨 论

肿瘤干细胞是存在于肿瘤组织中一小群具有自我更新和无限增殖潜能的细胞，它们可以分化成异质性的肿瘤细胞，是肿瘤形成的根源，也是肿瘤发生转移、化疗耐受、复发的主导因素[4,5]。肿瘤干细胞理论可以更好地解释肿瘤的生物学特性，也改变了传统的肿瘤治疗观念。如果找到肿瘤干细胞并以此为治疗靶点，可能从根本上治愈肿瘤。目前缺乏特异性的标记物是肿瘤干细胞研究的难题，更多的观点只是基于现象的理论推测。

Goodell等[6]在用DNA染料Hoechst33342为细胞染色的流式细胞仪分析中发现，有一群细胞染色偏低，与其它大部分细胞不一样，遂命名为SP细胞。这群细胞对多种染料和药物具有排斥作用，可能是其细胞表面的ABC转运载体将Hoechst33342泵出细胞体外的缘故[2]。包括肝癌在内的多种恶性肿瘤组织和肿瘤细胞株都存在SP细胞，提示SP细胞是存在于恶性肿瘤中的一个普遍现象[7-10]。进一步研究发现，从肿瘤细胞中分选出的SP细胞比NSP细胞具有更高的恶性行为，SP细胞可能代表了一群原始的干细胞[11,12]。目前，分选具有干细胞特性的SP细胞已成为多种肿瘤干细胞深入研究的有力工具。本研究利用流式细胞荧光激活分选技术分选肝癌SMMC-7721细胞中的SP细胞和NSP细胞，结果显示SMMC-7721细胞中SP细胞的比例为(9.2±0.2)%，加入钙离子通道阻滞剂verapamil后SP细胞比例为(0.0±0.0)%，证明肝癌SMMC-7721细胞中也存在一定比例的SP细胞。

细胞周期分析结果显示，肝癌SP细胞中处于静止期的细胞较NSP细胞多，差异显著。这与Benchaouir等[13]的研究结果一致。他们对SP细胞的细胞周期研究中发现，多数SP细胞是处于G0期的静止细胞，采用DNA芯片技术对SP细胞的转录情况进行分析，发现SP细胞的转录能力与主群细胞相比大幅降低，细胞内与细胞周期停滞相关的基因表达上调，而与细胞周期运行的相关基因表达下调，符合干细胞的慢周期特征。抗凋亡是肿瘤干细胞的特性之一，肿瘤组织中大多数肿瘤细胞经过有限增殖和更新后凋亡，而极少数肿瘤干细胞则成为肿瘤生长的“种子”[14]。本研究细胞凋亡结果显示，肝癌SMMC-7721细胞中的NSP细胞凋亡率显著高于SP细胞。

细胞生长曲线结果表明，SP细胞生长速度明显快于NSP细胞；平板克隆实验显示SP细胞的克隆形成率高于NSP细胞，且SP细胞形成的克隆较密集且直径较大。这可能是因为SP细胞中含有更多的干细胞，干细胞分化为祖细胞后增殖速度加快，形成更多更大的克隆。但即便是SP细胞，克隆形成率也只有35.5%左右，这一方面可能因为分选出的SP细胞中只有一部分是肝癌干细胞，另一个原因可能是荧光染料Hoechst 33342的细胞毒性以及分选过程中机械损伤导致细胞在培养过程中死亡。

侵袭转移是恶性肿瘤的生物学特性之一[15]，肿瘤细胞的异质性同样表现在这一复杂、多级过程中。在转移过程中，大约有90%侵入循环系统的转移细胞可以到达肿瘤转移灶，有2%的散在细胞可以组成微小转移，而只有0.02%或是更少的细胞可以发育成血管，形成转移灶的微环境[16]。从这一现象可以推测参与肿瘤侵袭转移的可能是肿瘤干细胞。本研究中Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示，SP细胞48 h穿过人工基底膜的细胞数远多于NSP细胞，提示SP细胞中可能存在参与肿瘤侵袭转移的肿瘤干细胞亚群。

裸鼠是细胞免疫缺陷动物，免疫力极低，是干细胞研究较好的实验动物。我们把分选出的SP细胞移植到裸鼠身上，观察SP细胞和NSP细胞的致瘤性，结果显示SP细胞成瘤能力明显高于NSP细胞。经过1次粗筛的SP细胞只需要1×103个细胞即可成瘤，而NSP细胞成瘤性显著减弱，但1×105NSP细胞组中也有肿瘤形成，其原因可能是分选的SP细胞亚群并不能代表所有的肿瘤干细胞，也可能是分选出的NSP细胞中可能含有少量的SP细胞。

综上所述，本研究证实肝癌SMMC-7721细胞中存在SP细胞，而且SP细胞的增殖、克隆形成、抗凋亡、迁移侵袭能力和成瘤能力均高于NSP细胞，SP细胞可能富集了肿瘤干细胞。研究结果将为我们后续针对SP表型治疗肝癌提供理论依据。

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BiologicalcharacteristicsofsidepopulationcellssortedfromhepatomaSMMC-7721cellline

HUANG Tao1, ZHOU Qi2, GONG Dong-wei3, GAO Quan-li4, ZHANG Xu-hua5, LÜ Xiao-dong5, ZHOU Jin-xue1

(1DepartmentofHepatopancreatobiliarySurgery,4DepartmentofCancerBiotherapy,5CentralLaboratory,TheAffiliatedTumorHospital,ZhengzhouUniversity,HenanTumorHospital,Zhengzhou450000,China;2DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;3DepartmentofGeneralSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofXinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China;E-mail:hbht68@163.com)

AIM: To study the biological characteristics of side population (SP) cells sorted from hepatoma SMMC-7721 cell line.METHODSFluorescence-activated cell sorter (FACS) was used to sort SP cells and non-SP (NSP) cells from SMMC-7721 cell line. The colony-formation ability and proliferation ability between SP cells and NSP cells were compared in terms of plate colony assay and growth curve. The migratory and invasive properties of SP cells and NSP cells were tested by Transwell method. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The oncogenicity of the cells was analyzed by nude mouse transplantation tumor experimentinvivo.RESULTSThe results of FACS analysis indicated that (9.2±0.2)% of the SMMC-7721 cells were SP cells. The proportion of G0/G1phase of SP cells was higher, and the apoptotic rate was lower than those of NSP cells (P<0.05). The proliferation ability and colony-forming ability and migratory and invasive properties of SP cells were significantly higher than those of NSP cells (P<0.05). The nude mouse transplantation tumor experiment displayed that the oncogenicity of SP cells was higher than that of NSP cells.CONCLUSIONThe SP cells sorted from SMMC-7721 cell line may enrich tumor stem cells.

Liver neoplasms; Side population cells; Tumor stem cells; SMMC-7721 cells

R735.7

A

1000-4718(2011)03-0523-05

2010-10-20

2010-11-30

河南省科技厅基础与前沿研究资助项目(No.082300450100)

△通信作者 Tel: 0371-65587025; E-mail: hbht68@163.com

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.03.020