乳酸乳球菌乳脂亚种高产丁二酮的条件优化

于田利，张佳程，范荣波，禇庆环

(青岛农业大学食品学院，山东青岛266109)

乳酸乳球菌乳脂亚种高产丁二酮的条件优化

于田利，张佳程，范荣波，禇庆环

(青岛农业大学食品学院，山东青岛266109)

分别研究了10种不同因素对乳酸乳球菌乳脂亚种产生丁二酮质量分数的影响。结果表明，各因素产生丁二酮最高量的条件：培养温度为37℃；凝乳后3 h；后熟12 h；培养基pH值调至为5.6；培养基中添加柠檬酸氢二铵的质量浓度为0.15%；培养基中添加Vc的质量浓度为0.3%。培养基中添加金属离子的质量浓度分别为：Mg2+为0.05%，Cu2+为0.04%，Mn2+为0.001%；培养基中添加甘氨酸的质量浓度为1.7%（均为质量分数）；培养基中添加碳水化合物的质量浓度分别为：葡萄糖为1%，蔗糖为1.5%（均为质量分数）；随着基质浓度增加丁二酮产量也随之增加。

乳酸乳球菌乳脂亚种；丁二酮；优化

0 引言

丁二酮，是一种黄色至浅绿色液体，稀释至1 mg/L时呈奶油香味[1，2]。在发酵乳制品的滋味与香味中，丁二酮被认为是起作用的重要化合物之一，是柠檬酸经一系列生化反应而合成的[3]。丁二酮具有抗菌作用[4]。作为食用香料，我国GB2760—1986规定允许食用，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008[5]。

代谢产生丁二酮的微生物很多，所有V-P反应呈阳性的微生物都可产生丁二酮[6]。

本实验主要通过单因素实验，研究乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)的培养温度及时间，后熟，培养基的pH值，在培养基中添加金属离子（Mg2+、Mn2+、Cu2+），Vc，柠檬酸氢二铵，不同碳源（葡萄糖、蔗糖），甘氨酸和培养基基质浓度对乳酸乳球菌乳脂亚种产丁二酮的影响，提高产丁二酮的能力，为酮香型酸奶的生产作准备。

1 实验

1.1 材料与仪器

乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)，完达山脱脂乳，液体MRS培养基（1L），蛋白胨10 g，K2HPO42 g，肉膏10 g，乙酸钠5 g，酵母提取物5 g，吐温80 1 mL，柠檬酸二铵，MnSO4·4H2O 0.25 g，MgSO4·7H2O，葡萄糖20 g，pH值为6.2～6.4，121℃灭菌15 min，乳酸，甘氨酸，MgSO4，MnSO4，CuSO4，Vc，柠檬酸盐，葡糖糖，蔗糖，16%三氯乙酸，浓度为4 mol/L盐酸，邻苯二胺溶液。

隔水式电热恒温培养箱，电子天平，TU-1800PC紫外可见分光光度计，手提式压力蒸汽灭菌器（YXQ.SG41.280），超净工作台(AIR TECH)SW-CJ-1F。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化和增值

配置质量分数为13%的脱脂乳，110℃高压灭菌15 min，挑取乳酸乳球菌乳脂亚种接种到已灭菌的脱脂乳中，放到30℃恒温培养箱中，直到活力稳定(活力＞13.4%)，凝乳质地均匀黏稠，可拉成长丝，无乳清分离，凝乳时间在15 h之内，可以单独作为发酵剂使用。将活化好的发酵剂接种到液体MRS培养基中扩大培养。

1.2.2 生长曲线的测定

采用比浊法测生长曲线。准备72支试管，每支倒入5 mL的液体MRS培养基,121℃灭菌15 min，将扩大培养好的乳酸乳球菌乳脂亚种接种到其中的48支试管中，作为两组平行试验，其他24支作为空白对照。放置在30℃恒温培养箱中培养；分别培养0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32，34，36，38，40，42，44，46 h后在波长600 nm处比色测定菌液的OD600值。

1.2.3 丁二酮的检测方法

采用邻苯二胺比色法，其原理是邻苯二胺与双乙酰反应生成2，3-二甲喹喔啉，该化合物在335 nm下有最大吸收峰。具体方法是三氯乙酸沉淀蛋白→离心→取上清液→加邻苯二胺黑暗处放置30 min→加盐酸→紫外分光光度计OD335。

1.2.4 双乙酰标准曲线的建立[5]

（1）用微量进样器吸取15 μL双乙酰标准品，溶于蒸馏水中，并定容至500 mL。

（2）取14支编号的试管分成2排放置，并分别加0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12 mL的标准溶液各2支，分别用蒸馏水补足10 mL，取5.0 mL上述双乙酰标准溶液加入质量分数为8%的三氯乙酸溶液，这样双乙酰标准溶液的质量浓度分别为0.0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0，18 mg/L。

（3）第一排试管中加入0.5 mL质量分数为1%的邻苯二胺溶液，第二排试管不加为空白；摇匀后置于黑暗处放置30 min。

（4）反应完全后加入浓度为4.0 mol/L盐酸终止反应，第一排试管加2.0 mL，第二排试管加2.5 mL，混匀后以第二排试管空白作为参比液，在335 nm波长下用石英比色皿测定吸光度值。

（5）以双乙酰质量分数为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5 实验条件优化

分别实验研究培养温度、时间、pH值、基质浓度、后发酵时间、添加金属离子（Mg2+，Mn2+，Cu2+）、Vc、柠檬酸、甘氨酸、碳源（葡萄糖、蔗糖）对乳酸乳球菌乳脂亚种产丁二酮的影响。

2 结果与分析

2.1 乳酸乳球菌乳脂亚种的生长曲线

乳酸乳球菌乳脂亚种的生长曲线如图1所示。

由图1可以看出，接种6 h后乳酸乳球菌乳脂亚种即开始生长，进入指数期；接种8 h后进入稳定期。

2.2 丁二酮质量浓度标准曲线

按照前面方法绘制标准曲线，用微量进样器取样品15 μL,稀释成质量浓度分别为0.0，3.0，6.0，9.0，12.0，15.0，18 mg/L，在335 nm波长下用石英比色皿测

图1 乳酸乳球菌乳脂亚种的生长曲线

定吸光度值，结果如图2所示。

图2 丁二酮浓度标准曲线

由图2可以看出，标准曲线的相关性较好，相关系数达到0.99以上。得到的回归方程式y=0.0691x+0.0109。

2.3 培养温度及凝乳后时间的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到灭菌后的13%脱脂乳中，接种量为3%；分别放到25，30，37℃的恒温培养箱中培养，凝乳后，分别在0，3，6，9 h后，测丁二酮的产生量，结果如图3所示。

图3 不同温度不同凝乳后时间的影响

由图3可以看出，乳酸乳球菌乳脂亚种在37℃下培养呈现出明显的优势，且在凝乳后3 h产生丁二酮的质量浓度最高，达到8.769 mg/L。因此，选择37℃为菌种培养的温度。

2.4 后熟及pH值的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到已灭菌的13%的脱脂乳中，接种量为3%，放到37℃恒温箱中培养，凝乳后，放到0～4℃冷藏箱中后熟，后熟时间分别为0 h，12 h，24 h后测丁二酮的质量浓度，结果如图4所示。

图4 后熟对产丁二酮的影响

同时配质量分数为13%的脱脂乳，灭菌后在无菌条件下用乳酸调节pH值分别为4.8，5.6，6.4，接入乳酸乳球菌乳脂亚种，放到37℃恒温培养箱中培养，凝乳后，测丁二酮的产量，结果如图5所示。

图5 pH值对产丁二酮的影响

由图4可以看出，后熟12 h后，丁二酮的产量最高，达到13.437 mg/L。这是由于后熟促进了丁二酮的产生，在12 h达到了高峰。由图5可以看出，在pH值为5.6时丁二酮的产量最高，达到9.438 mg/L。由此得出乳酸乳球菌乳脂亚种产丁二酮的最佳pH值为5.6。

2.5 柠檬酸及Vc对产丁二酮的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到灭菌后添加了柠檬酸盐的13%脱脂乳中，添加量分别为0，0.1%，0.15%，0.2%，放到37℃恒温培养箱中培养，凝乳后测丁二酮的产生量，结果如图6所示。

图6 柠檬酸盐的添加量对产生丁二酮的影响

同时将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到分别添加了0，0.01%，0.05%，0.1%,0.2%，0.3%，0.4%，0.5%的Vc的灭菌脱脂乳中，放到37℃的恒温培养箱中，凝乳后测丁二酮产生量，结果如图7所示。

图7 Vc的添加量对产生丁二酮影响

由图6可以看出，可见柠檬酸盐的质量浓度对产丁二酮有促进作用，这是因为乳酸乳球菌可利用柠檬酸产生丙酮酸，而丙酮酸可用来合成丁二酮，并且，柠檬酸的加入可部分的阻遏丁二酮还原酶的产生，最终使丁二酮高产。但当添加柠檬酸盐的量为0.15%时，丁二酮的产量最大，达到13.661 mg/L。说明乳酸乳球菌乳脂亚种对柠檬酸盐的浓度存在适当的最适范围。

由图7可以看出，当添加Vc的量为0.3%时产生丁二酮的量最高，达到13.153 mg/L。可见Vc可促进乳酸乳球菌乳脂亚种产生丁二酮。

2.6 金属离子对产丁二酮的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到分别添加了（0，0.05%，0.1%，0.15%）MgSO4，（0，0.01%，0.02%，0.03%，0.04%，0.05%）CuSO4和（0，0.001%，0.002%，0.003%，0.004%）MnSO4的灭菌脱脂乳中，放置到37℃的恒温培养箱中培养，凝乳后测丁二酮的质量浓度，结果如图8～图10。

图8 Mg2+对产生丁二酮的影响

由图8可以看出，Mg2+是丁二酮产生的生长因子，当添加Mg2+的量为0.05%时丁二酮的产量最高，达到15.203 mg/L。而高质量浓度的Mg2+则抑制了丁二酮的产生。

由图9可以看出，当添加Mn2+的量为0.001%时产丁二酮的量最高，达到17.522 mg/L。这是由于少量的Mn2+刺激对柠檬酸的利用，从而产生较多丁二酮，但是额外的Mn2+有副作用，可以降低丁二酮的产量[7]。

图9 Mn2+对产生丁二酮的影响

图10 Cu2+对产生丁二酮的影响

由图10可以看出，当添加Cu2+的量为0.04%时，产生丁二酮的量最高，达到13.656 mg/L。

2.7 不同碳源对产丁二酮的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到分别添加了（0%，1%，2%，3%，4%）葡萄糖和（0%，0.5%，1%，1.5%，2%）蔗糖的13%的灭菌脱脂乳中，放置到37℃的恒温培养箱中培养直至凝乳，凝乳后测丁二酮的产量，结果如图11和图12所示。

图11 葡萄糖的添加量对生丁二酮的影响

图12 蔗糖的添加量对产生丁二酮的影响

由图11可以看出，当添加葡萄糖的量为1%时丁二酮的产量最高，达到17.038 mg/L。

由图12可以看出，当添加蔗糖的量为1.5%时丁二酮的产量最高，达到13.632 mg/L。

2.8 不同甘氨酸添加量及基质质量分数对产丁二酮的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到分别添加了（0%，0.5%，0.8%，1.1%，1.4%，1.7%，2.0%）的甘氨酸的13%的灭菌脱脂乳中，放置到37℃的恒温培养箱中直到凝乳，凝乳后测丁二酮的质量浓度，结果如图13所示。

图13 甘氨酸的添加量对产生丁二酮的影响

将乳酸乳球菌乳脂亚种接种到不同基质浓度中，分别调整质量分数为10%，13%，18%，20%，22%，24%，26%，放置到37℃的恒温培养箱中培养直至凝乳，凝乳后测丁二酮的质量浓度，结果如图14所示。

图14 不同基质质量分数对产生丁二酮的影响

由图13可以看出，当添加甘氨酸的量为1.7%时丁二酮的产量最高，达到10.566 mg/L。

由图14可以看出，随着基质质量分数的增加，丁二酮的产量一直呈上升趋势。

3 结论

通过实验得出，37℃培养，凝乳后3 h，在脱脂乳中外加加蔗糖量为1.5%，葡萄糖量为1%，柠檬酸量为0.15%，Vc量为0.3%，甘氨酸添加量为1.7%，pH值为5.6，MgSO4添加量为0.05%，MnSO4添加量为0.001%，CuSO4添加量为0.04%（均为质量分数），后熟时间为12 h时，乳酸乳球菌乳脂亚种产生丁二酮量最高，同时随着基质质量分数的增大丁二酮的产量也呈上升趋势。

[1] MECULLAGH E，HODELL B K.Vanadium Oxides as Regenerable Reagents in the Oxide of Butanone to Diacetyl[J].Appl Catala:General,1993(97):39-47.

[2] YASAKU T.Oxidation of Ketones over Metal Oxide Catalysts Diacetyl Synthesis over Coball Oxide Lanthanoid Oxide Catalysts[J].Chem Soc Japan,1987(8):2757-2762.

[3] LEE W.Production of Diacetyl(2,3 Butanediol)by Continuous Fermentation with Simultaneous Product Separation[D].USA:Purdue University,PhD the2sis,1991.

[4] 赵玲,王静云,包永明，等.丁二酮高产菌株的选育及发酵动力学分析[J].生物技术,2007，17（5）：59-64.

[5] Code of Federal Regulations.Title 21,Part131.Milk and Cream[S].Office Fed,Reg.,Natl.Archiv.Rcords Admin.,Washington,D C，1990，152-154,161-168.

[6] 邵亚东.传统发酵乳制品中乳酸菌产双乙酰特性的研究[D].内蒙古农业学，2007.

[7] 孟祥晨,杜鹏,李艾黎，等.乳酸菌与乳品发酵剂[M].北京:科学出版社,2009:122.

Research on the optimization of producing Diacetyl of L.lactis subsp.cremoris

YU Tian-li,ZHANG Jia-cheng,FAN Rong-bo,CHU Qing-huan
(Department of Food,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

Study on the influence of producing diacetyl with different factors to Lactococcus lactis subsp.cremoris.It was found that,the best condition that producing high yield diacetyl is that culture temperature is 37℃;curd after3 h;after-ripening 12 h;medium adjusted pH to 5.6;medium added amount of citric acid 0.15%;medium add the amount of Vc 0.3%;medium added amount of metal ions were:Mg2+was 0.05%,Cu2+was 0.04%,Mn2+was 0.001%;medium added glycine was 1.7%;medium added carbohydrate content were:glucose 1%,sucrose 1.5%,and with increasing concentration of skim milk diacetyl yield increased.

Lactococcus lactis subsp.cremoris;Diacety;optimization

Q93-335

A

1001-2230（2011）02-0017-04

2010-11-15

于田利（1985-），女，硕士，研究方向为畜产品加工。