酪蛋白磷酸肽钙-乳清蛋白复合膜物理性质的研究

李 彬，刘 飞，李昇乐，李英杰，冷小京

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

酪蛋白磷酸肽钙-乳清蛋白复合膜物理性质的研究

李 彬，刘 飞，李昇乐，李英杰，冷小京*

(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)

在乳清分离蛋白(WPI)基础膜中引入酪蛋白磷酸肽钙(CPPs)制备成富钙的单层复配膜和双层复合膜，并对膜的有关物理性质(机械强度、含水量、水蒸气透过系数)进行评价。单层复配膜中CPPs与WPI的最大百分比为8%，总钙含量最高为0.59%。CPPs的添加量对所测膜的物理性质没有显著影响(P＞0.05)。双层复合膜可使总钙含量高达28%以上，但同时也使膜的机械强度较单层复配膜降低近一半，且含水量显著降低(P＜0.05)。

酪蛋白磷酸肽钙；乳清分离蛋白；单层复配膜；双层复合膜

乳清蛋白是乳清液的主要成分，可形成柔软、有弹性、不溶于水的可食用包装膜[1-2]，且具有良好的阻隔氧气、芳香物质和油脂的性能[3]。随社会需求的发展，提高相关膜产品的多功能特性成为食品科学领域中的热点。比如，为增强可食用膜的抗菌性能，Seydim[4]、Cagri[5]、Franssen[6]等在膜中加入大蒜精油、山梨酸等抑菌剂；为提高膜的营养特性，Mei等[7]利用蛋白质高分子网状结构搭载维生素、葡萄糖酸钙和乳酸钙等功能因子。值得注意的是，合理有效地设计可食用包装膜中钙的组成，强化食品中钙的含量，对改善我国目前膳食结构中普遍存在的钙摄入量偏低[8-9]的问题，更有现实的应用价值。

在乳清蛋白膜中提高钙的含量很不容易[10-11]。因为钙离子的加入过高会导致蛋白凝聚，无法形成膜。此外，无机钙离子在肠道中性或微碱环境中极易与氢氧根、磷酸根等离子形成水不溶性盐，也影响钙的吸收利用。酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptide，CPPs)是一类富含-Ser(P)-Ser(P)-Ser(P)-Glu-Glu-结构的生物活性肽[12]，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，即酪蛋白磷酸肽钙，这种复合物可以有效阻止钙在小肠的中性或微碱性环境中形成沉淀[13]。因此，以乳清蛋白膜承载CPPs，不但有可能提高乳清蛋白膜的总钙含量，还可以提高人体对钙的利用率。目前国内外对CPPs与乳清蛋白(whey protein isolate，WPI)复配可食用膜报道不多，数据缺乏，因此本研究的重心是通过WPI与CPPs的复配，形成富钙的单层或双层包装膜，并探讨其物理性能，为此方面工作的展开提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白(WPI，蛋白质含量≥97%) 美国Davisco食品公司；酪蛋白磷酸肽钙(CPPs，纯度≥80%，钙含量7.4%) 广州美晨集团股份有限公司；甘油、NaOH均为分析纯 北京化工厂。

1.2 仪器与设备

DK-8B型电热恒温水浴锅、DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司；HWS恒温恒湿培养箱宁波江南仪器厂；数显千分尺成都成量有限公司；CAL1501钙离子选择电极美国Van London-pHoenix公司；TMS-PRO质构仪美国FCT公司；DelsaNano纳米粒度及Zeta电位分析仪美国贝克曼库尔特有限公司；Hitachi S-5500超高分辨率扫描电子显微镜日本日立公司。

1.3 样品制备

溶液Ⅰ：称取一定质量的WPI溶于去离子水中，使溶液质量分数为10%，搅拌2h使其完全溶解，用1mol/L NaOH调pH值至8，90℃水浴处理30min[14]。

溶液Ⅱ：称取一定质量的CPPs溶于去离子水中，使溶液质量分数为10%，搅拌至完全溶解，用1mol/L NaOH调pH值至8。CPPs的最大溶解量为40%，但CPPs在30%和40%时铺成的膜有龟裂趋势，因此选20%作为双层复合膜的第二层膜。

1.3.1 CPPs-WPI单层复配膜的制备

将溶液Ⅱ缓慢加入溶液Ⅰ中，并添加一定量甘油(Glycerin:WPI 体积比 1:2)和一定量的去离子水搅拌均匀后超声脱气10min得成膜液。体系终含量：WPI质量分数为8%，CPPs与WPI的质量百分比分别为0%、1%、3%、5%、7%和8%。称量5g成膜液，倒入有机玻璃皿(直径8cm)中，在恒温恒湿箱内(T = (22 ± 2)℃，RH =(56 ± 2 )%)平衡48h成膜，并立刻开始测量各项指标。

1.3.2 双层复合膜的制备

分别称取上述CPPs最大添加量的成膜液3、2.5、2g倒入有机玻璃皿(直径8cm)中，在恒温恒湿箱内(T=(22±2)℃，RH=(56±2)%)平衡48h后，再分别称取溶液Ⅱ 2、2.5、3g均匀覆盖在上述已平衡的膜上，在恒温恒湿箱内(T=(22±2)℃，RH=(56±2)%)平衡48h成膜，并立刻开始测量各项指标。

1.4 膜微观形态扫描电镜分析

待测的膜样品经过液氮冷冻处理，保持截面的原始状态，然后用高纯银浆将其固定在铝片上，风干后喷碳，用扫描电镜观察截面。

1.5 单层复配膜成膜液研究

1.5.1 相应浓度CPPs水溶液中游离钙含量的测定

单层复配膜成膜液中溶液Ⅰ用等量的去离子水替代，配制成相应浓度CPPs水溶液，用钙离子选择电极测水溶液中游离钙含量。

1.5.2 成膜液电势和粒径的测定

单层复配膜成膜液的Zeta电势和粒径用DelsaNano纳米粒度及Zeta电位分析仪测量。

1.6 单层复配膜和双层复合膜性能的测定

1.6.1 膜厚度

选择完好、均匀的膜，随机取10个点，用数显千分尺测量其厚度，取平均值。

1.6.2 拉伸性能

参照GB/T12914— 91《纸与纸板抗张强度测定方法》[15]，略有改动，使用TMS-Pro质构仪的拉伸装置，拉伸速度为1mm/s。拉伸强度(TS，N/mm2)和断裂拉伸率(E，%)可从压力-应变曲线上计算获得。每个膜样品的大小为40mm×6mm。

式中：Ft为最大拉力/N；L为膜样品的厚度/mm；W为膜样品的宽度/mm。

式中：L0为样品拉伸前的原始长度/mm；ΔL为样品断裂时被拉长的长度/mm。

1.6.3 水蒸气透过系数

水蒸气透过系数(water vapor permeability，WVP)是指保持试样两表面特定的温湿度环境，在单位时间内，由试样两侧单位水蒸气压差引起的，单位厚度的样品在其单位面积上透过的水蒸气总量。测量方法采用拟杯子法。参照GB1037—88《塑料薄膜和片材透水蒸气试验法 杯式法》，并略有改动[16]。将完整均匀的膜密封在自制有机玻璃透湿杯表面，膜外露面积为19.6cm2，杯内装有30g干硅胶。将透湿杯放入恒温恒湿箱内(T = (22 ± 2)℃，RH = (56 ± 2)%)平衡2h，然后测6h后透湿杯的增加质量。按式(3)计算膜的WVP的值。

式中：m为透湿杯的增加质量/g；x为膜的厚度/mm；A为膜外露面积/cm2；t为测量间隔时间/h；ΔP为膜两侧的水蒸气压差/kPa 。

1.6.4 含水量(MC)

称取质量为m0的膜放在105℃的烘箱中干燥24h，称质量，计算干燥前后膜质量损失为Δm。

1.7 数据分析

数据分析采用Origin 8.0和SPSS 16.0软件。样品显著性分析采用单向方差分析和邓肯多重比较法(α=0.05)，每个样品至少重复3次。

2 结果与分析

2.1 膜电镜图像分析

图1为相关膜样品截面的电子扫描图像。其中A为纯WPI膜的截面图，网络结构比较均匀光滑，这与已有的研究结果相符[11]。随着CPPs量的增加，截面逐渐出现聚集现象，如图B所示。此聚集现象与CPPs中钙含量的增加有关系。图C为放大500倍的双层复合膜截面图，图中可以看到明显的界面。膜厚度约100μm。图D为放大105倍的双层复合膜截面图，同样可以看见双层膜之间有十分明显的界面，下层为WPI与CPPs的复配膜，上层为纯CPPs膜，比较均匀光滑。虽然双层之间截面比较明显，但因蛋白质分子与肽段分子之间的各种相互作用，如氢键作用、疏水相互作用、范德华力等[17]，使双层膜互相结合紧密，无法再分开。

图1 膜样品截面扫描电镜图Fig.1 SEM micrographs of the film cross sections

2.2 游离钙作用的分析

前期研究表明[11]，在8%的WPI成膜液中，当Ca2+的含量超过0.45%，蛋白体系会迅速凝胶而无法成膜。图2展示了随着CPPs-WPI混合比例的上升，体系中游离Ca2+含量的变化趋势。当CPPs-WPI混合比例达到最大值8%时，虽然体系总钙含量为0.59%，已超过了上述的凝胶极限，但由于游离Ca2+含量为0.34%，仍低于极限浓度，故未导致凝胶发生。这说明CPPs具有降低游离Ca2+含量的能力，而体系凝胶现象仅取决于游离Ca2+的含量，而非体系总钙含量。

图2 CPPs水溶液体系中游离钙离子的含量Fig.2 Free calcium content in the CPPs solutions

2.3 电势与粒径分析

图3 成膜液的Zeta电势和粒径测量Fig.3 Zeta potential and size measurements of the film solution

图3描述了随CPPs添加量的增大，单层复配膜成膜液的电势绝对值和粒径均呈下降的趋势。因为WPI的等电点在5.1附近，所以蛋白质分子在pH8条件下带负电荷。分子间静电斥力的存在可导致蛋白质聚合物处于膨胀状态，粒径较大。加入CPPs可使体系内游离Ca2+含量上升(图2)。Ca2+对蛋白质分子表面负电荷的静电中和，降低了分子的表面电势，减弱了分子间的电荷斥力，形成紧密的蛋白质-钙-蛋白质钙桥结构，导致聚合物收缩，粒径降低。在膜的形成过程中，这种聚集收缩会造成如图1B所展示的颗粒状膜结构。类似现象在文献中多有报道[18-19]。尽管CPPs的加入可有效提高膜体系的总钙含量，但游离钙离子引发蛋白分子聚集，最终仍影响膜的形成，因此CPPs的使用仍然存在用量极限问题。双层膜的设计可大幅度提高膜体系中总钙的含量。

2.4 膜的机械强度

图4比较了随着CPPs添加量的增加，单层及双层膜各样品拉伸强度(TS)和断裂拉伸率(E)的相对差异。由图4可见，在单层复配膜体系中，TS和E并无显著性差异(P＞0.05)。这一现象与文献报道存在不同，据报道，在乳清蛋白加热变性过程中，蛋白凝胶的机械性能主要由分子间相互作用如氢键、疏水相互作用、范德华力及双硫键等决定。Ca2+加入后，若游离散布在整个体系内，可借助静电作用来调节蛋白质分子间的反应。虽然其作用效果小于加热处理[13]，但低含量的Ca2+仍能显著提高膜的机械性能[20-21]。而当体系中加入CPPs后，因肽链上磷酸根功能团的吸引，游离Ca2+不易扩散到整个体系中，难以使膜的整体机械性能发生显著变化。与单层复配膜相比，双层复合膜的拉伸性能大幅度下降。这是因为，首先，纯CPPs层的原料属于酪蛋白水解产物，肽段较短，无法交联形成高机械强度的网络结构；其次，双层膜中提供机械强度的主要部分是CPPs/WPI复配膜层，与同质量的单层复配膜体系相比，双层膜体系中CPPs/WPI的用量相对较少，因此膜整体的机械强度也随之降低。

图4 样品的拉伸强度和断裂拉伸率Fig.4 Tensile strength (TS) and elongation rate (E) of different sample films

2.5 膜的水蒸气透过系数(WVP)及含水量(MC)

图5 样品的水蒸气透过率和含水量Fig.5 Water vapour permeability (WVP) and moisture content (MC) of different sample films

图5比较了随着CPPs添加量的增加，各样品WVP及MC的相对差异。需要说明的是，因WVP是均匀材料的特性参数，所以本实验忽略了单层与双层膜WVP的对比[22]。单层复配膜的WVP差异不显著(P＞0.05)。WVP与膜中网络结构的微小通道有关[16]，并受很多因素如膜的完整性、结晶区和无定形区的比例、疏水区和亲水区的比例、高分子链的流动性等的影响。此外，Ca2+可以在蛋白膜中形成分子交联，强化蛋白网络结构并提高其阻水性能[20]；然而蛋白网络结构的不均匀性又会形成新的通道；此外，CPPs较强的水溶性和Ca2+的吸湿性也有助于水分子的通过。数种作用相互平衡，从而使体系WVP的综合变化不明显。MC的特征与WVP表现不同。在单层复配膜中，随CPPs的增加，MC呈下降趋势。MC是表达膜微观网络结构中水分子所占体积的参数，反映了膜的持水能力[16]。如图1所示，随着CPPs含量的增加，钙含量增多，膜内蛋白分子呈现自聚集趋势，膜内自由体积减少，因而导致MC降低。双层复合膜的MC较单层复配膜显著降低(P＜0.05)，这主要是因为双层复合膜中的纯CPPs层持水性能很弱，降低了整体的性能。

3 结 论

3.1 通过WPI与CPPs的复配，可制备具有补钙功能的新型可食用膜体，提高了包装膜的营养功能特性。

3.2 单层膜中CPPs的添加使膜的微观结构发生了明显变化，蛋白分子之间发生了聚集现象，但膜的相关物理性质(机械强度、含水量、水蒸气透过系数)变化并不显著(P＞0.05)。此外，与直接添加无机钙相比，CPPs的添入不仅提高了膜体总钙含量，还提高了钙的利用率。

3.3 双层复合膜的设计解决了单层膜载钙量过低的问题，总钙最高含量可超过28%。然而膜的机械强度较单层膜降低了近一半。

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Physical Properties of Blended Film with Whey Protein Isolate and Casein Phosphopeptide

LI Bin，LIU Fei，LI Sheng-le，LI Ying-jie，LENG Xiao-jing*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

The preparation and characterization of the single- and double-layer edible packaging films using the casein phosphopeptide (CPPs) and whey protein isolate (WPI) were performed in this study. The CPPs content could reach 8% (Ca/WPI) in the single-layer composite film and the calcium contained could attain 0.59% (Ca/WPI). Addition of CPPs had no significant effects on the physical properties (moisture content, water vapour permeability, tensile properties etc.) of the singlelayer films (P ＞0.05). The double-layer film was designed to increase the calcium content, and the maximum content of calcium could be above 28% (Ca/WPI); however, its tensile strength and moisture content were reduced compared with the single-layer one (P ＜0.05).

casein phosphopeptide；whey protein isolate；single-layer composite films；double-layer composite films

TS201.21

A

1002-6630(2011)03-0001-05

2010-04-16

国家“863”计划项目(2007AA10Z311)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2006BAD04A06)

李彬(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为食用膜及微胶囊科学。E-mail：siyulibin@163.com

*通信作者：冷小京(1966—)，男，副教授，博士，研究方向为可食用膜及微胶囊科学。E-mail：xiaojing.leng@gmail.com