博士1:4对蚯蚓的毒性效应研究

李 冰，白桂芬，张 帅

（赤峰学院 生命科学系，内蒙古 赤峰 024000）

博士1:4对蚯蚓的毒性效应研究

李 冰，白桂芬，张 帅

（赤峰学院 生命科学系，内蒙古 赤峰 024000）

采用滤纸接触法和自然土壤法对内蒙古赤峰市周边地区蚯蚓进行染毒，研究了赤峰市周边地区普遍使用的博士1：4对蚯蚓的毒性效应.单一试验的结果表明：两种方法均能引起蚯蚓中毒或死亡，滤纸法48h时博士1：4半致死浓度(LC50)为2.8732g/L.自然土壤法14d时蚯蚓有明显中毒现象，但无死亡情况.

蚯蚓；博士1：4；单一污染；滤纸接触法；自然土壤法

土壤是人类赖以生存的基础，土壤质量状况与人类的健康和发展息息相关.随着工业和石油农业迅猛发展，工业废弃物、化肥和农药等污染物质的大量排放和施用，给土壤环境造成相当严重的影响，也给人类健康带来潜在风险.因此，对土壤质量的评价和污染物质毒性的测定是必要的.蚯蚓生态毒理试验正是在这样的需要下发展起来的[1].蚯蚓作为土壤无脊椎动物的代表，在保持和改善土壤结构、提高土壤肥力、改善土壤透气性、吸收并降解土壤中的有机物等方面有着重要作用[2].蚯蚓是常见的杂食性环节动物，在土壤生态系统中具有极其重要的地位，常被作为土壤污染的指示动物，广泛用于土壤生态毒性研究[4].因此蚯蚓在农田中具有不可或缺的重要作用.随着工农业的发展，人类为了满足日益增长的各种需求，追求农田利益的最大化，在农业中普遍使用化肥、农药的现象明显增加.但化肥、农药显著增加了农业利益的同时，也给土壤环境带来了巨大的负面影响，致使农药污染的现象也日趋严重.本试验以蚯蚓为实验材料以内蒙古赤峰地区普遍使用的农药博士1:4为代表，对生物农药的安全可靠性进行检测，为赤峰市周边地区农药污染的生态学检测、农业害虫的生物学防治提供理论依据，同时也为科学地评价这种农药的生态安全性积累基础数据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试动物：蚯蚓在赤峰市周边地区蔬菜大棚中采集，试验选择体重为400～500mg，环带明显，大小基本一致的健康成蚓.供试土壤：采用蚯蚓原生地土壤，主要采集表层土（0～20cm），采回后经筛细待用.供试污染物：博士1:4，主要成分为二嗪磷，是广谱性有机磷杀虫剂，具有触杀、胃毒和一定的内吸作用.其作用机理为抑制酰胆碱酯酶，二嗪磷，英文通用名称：Diazinon，分子式：C12H21N2O3PS，化学名称:O，O-二乙基-O-（2-异丙基-6-甲基-4-嘧啶基）硫逐磷酸酯，结构式：

本实验采用的农药博士1:4是由河南农业大学与中国农业大学联合研制，由河南农业大学生物化工实验厂生产，生产日期为2009年10月1日，生产批件：HNP41025-A6814，执行标准：Q/HNSH03-2006，登记证号：SY20067618，保质期为两年.试验器材：玻璃培养皿（直径15cm，高2.5cm），滤纸（直径 15cm，中速），塑料小桶（上直径15cm,下直径10cm高8cm，容量1000mL），烧杯等.污染物试验浓度设计：正式试验前进行浓度范围选择试验,确定污染物对蚯蚓染毒历时48h时（滤纸法）和14d（自然土壤法）的最小致死浓度和最大致死浓度，在此区间内设置各污染物水溶液的正式单一毒性试验浓度序列.最后确定滤纸法的试验浓度为：1.5;2.0;2.5;3.0;3.5;4.0g/L；自然土壤法的试验浓度：30;40;50;60;70;80g/L.

1.2 试验方法

1.2.1 滤纸接触法

将挑选的蚯蚓洗净表面泥土后放入1L的已湿润的烧杯中，置于暗处清肠一昼夜（以除去肠道内的杂物等）[7].在玻璃培养皿中铺滤纸（中速）3张，以刚好遮住皿底为宜.将10mL博士1:4水溶液按试验设计浓度注入垫有3张滤纸的培养皿中，使滤纸全部浸湿.每一浓度设置3个重复，并设置1个不含药物的空白对照，再将清肠后的蚯蚓冲洗干净，用滤纸吸去多余水分[8].每处理放入10条蚯蚓，用保鲜薄膜封口，并用解剖针扎孔保持透气.定期观察并记录毒理症状和行为；并于24h、48h各观察1次死亡数，以前尾部对机械刺激无反应视为死亡[8].将试验数据输入计算机，应用简明统计10.35（Concise Statistics,CS10.35)进行统计学处理.

1.2.2 自然土壤法

将蚯蚓洗净后放入1L烧杯中，喷洒少量水，清肠24h.将500ml蚯蚓原生地土壤倒入解剖盘中，按实验设计浓度分别量取10mL博士1:4水溶液放入土壤中混匀后倒入塑料小桶.再将清肠后的蚯蚓冲洗干净，用滤纸吸去多余水分[8].每处理放入10条蚯蚓，如此每浓度分别设计3个重复.放置阴暗处，并于每天7时、18时各喷水一次以保持土壤湿度.观察并记录蚯蚓中毒症状；并于7d、14d各计数1次，以前尾部对机械刺激无反应视为死亡[8].将试验数据输入计算机，应用简明统计10.35（Concise Statistics,CS10.35)进行统计学处理.

2 结果

2.1 滤纸接触法测定博士1:4对蚯蚓的单一毒性

博士1:4单一污染蚯蚓表现出的中毒症状如下：在滤纸实验开始时，蚯蚓皮肤与农药直接接触，所以蚯蚓有强烈的反应，非常活跃.3h到4h观察时，则活动减弱.7h到8h观察时，蚯蚓身体蜷缩，抱团聚在一起并伴有轻微中毒现象，身体微肿，体色略变暗.10h到12h观察时蚯蚓中毒现象明显，体色变暗为深紫色，身体缩短、蜷缩，体节特别明显，身体及生殖环肿大.行动明显减弱.18h到20h观察时蚯蚓已经出现个别死亡情况，中毒现象严重，身体虚弱行动很少.由表1可见，博士1:4的浓度为1.5g/L至4.0g/L时，污染暴露24h对蚯蚓不产生致死效应.当污染暴露48h对蚯蚓表现明显的致死效应.且蚯蚓死亡率随污染浓度的增大而升高（见表1，图1）.对表1的试验数据进行统计分析，以博士1:4的浓度为横坐标，蚯蚓的死亡率为纵坐标，得到回归方程如下：

D=27.049X1--27.719(R2=0.98983595,n=6,P<0.005)①

表1 博士1：4滤纸接触法蚯蚓死亡情况

图1 博士1：4滤纸接触法不同浓度和时间条件下蚯蚓的死亡率

其中，D为蚯蚓死亡率（%），X1为博士1:4浓度（g/L），P为显著性水平，R为相关系数，n为试验处理数.根据上述方程可计算出博士:4的LC50为2.8732g/L.

2.2 自然土壤法测定博士1:4对蚯蚓的单一毒性

试验3d后检查时，蚯蚓有明显的中毒现象，具体表现为身体肿大并伴有僵硬现象，身体缩短，体色发暗为深紫色，环节突出，活动减少.7d时中毒现象与三天时一样，但现象更加明显，无死亡现象.但在第12d时，蚯蚓中毒现象略为缓解，分析可能为农药在土壤中药效降解的原因所致.14d检测时发现蚯蚓中毒症状有明显的降低趋势，身体缩短状况与僵硬现象明显好转，无死亡现象.将实验时间延长一周后，蚯蚓中毒情况明显减弱，未出现死亡情况.但由于蚯蚓在塑料盆里养殖时间过长，体质变弱.由于14d时蚯蚓无死亡现象，所以无实验数据.（表 2，图 2）.

表2 博士1：4自然土壤法法蚯蚓死亡情况

图2 博士1：4自然土壤法不同浓度和时间条件下蚯蚓的死亡率

3 讨论与分析

博士1:4的主要成分二嗪磷为中毒性，具有触杀、胃毒和一定的内吸作用.主要适用范围是对鳞翅目、同翅目等多种害虫均有较好的防治效果，防治多种作物的地下害虫.二嗪磷是广谱性有机磷杀虫剂，其作用机理为抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）.AChE在蚯蚓的神经传递过程中起着重要作用.AChE的活性主要用于评价有机磷农药和氨基甲酸酯类农药对蚯蚓的毒性效应.这两类农药均可抑制蚯蚓AChE活性，从而使蚯蚓神经传递受阻[9].

3.1 滤纸接触法测定博士1:4对蚯蚓的单一毒性

滤纸接触法是直接将蚯蚓暴露在一定浓度的农药环境下的试验方法，简单易行，可以初步了解化学药品的固有毒性和对土壤动物的潜在毒性[10].从博士1:4对蚯蚓的单一毒性试验结果看，在滤纸试验中24h和48h时，博士1:4单一毒性试验组的蚯蚓的LC50为2.8732g/L，博士1:4对蚯蚓的毒害随着培养时间的增加而增加，随着农药浓度的增加而增加，说明博士1:4对蚯蚓是有毒害作用的，而蚯蚓也对博士1:4有一定的耐受能力.如果农药浓度过高，超出了蚯蚓的耐受能力，则会危害蚯蚓的生长和生存.

3.2 自然土壤法测定博士1:4对蚯蚓的单一毒性

在自然土壤法的预实验中，连续多次提升农药浓度但蚯蚓在14d内并没有死亡情况，分析原因一方面可能是市面上的农药博士1:4虽然是08年以后出产，但生产所用原料全是08年所产，由于这些原料放置时间过长而导致药效降低.另一方面，自然土壤法的特点是简便易行，可用于具体地区污染物的环境安全性评价，但各地区试验结果可比性差[11].不同地区、环境中的土壤对药物的降解情况有所不同.而药物通过接触对蚯蚓产生的毒性不仅取决于药物的固有毒性，还与药物在土壤中的状态及在蚯蚓体内的药物代谢动力学密切相关[10].而且博士1:4是药肥一体的农药，毒性成分二嗪磷含量较低，所以蚯蚓在较高的实验浓度下未发生死亡情况.

从实验结果来看，在自然土壤法中蚯蚓虽然没有死亡情况，但有明显的中毒现象，所以在农药浓度的选取上还有待研讨.本实验研究将继续进行.

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X174

A

1673-260X（2011）03-0140-03

内蒙古自治区教育厅高等学校研究项目(NJ10249);赤峰学院重点扶持学科项目资助