富硒酸奶发酵剂的制备及其发酵性能研究

刘 冬，叶 明,*，叶玉娥，岳 鹏，王 瑾，胡必腾

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.安徽曦强乳业集团有限公司，安徽 淮北 235000)

富硒酸奶发酵剂的制备及其发酵性能研究

刘 冬1，叶 明1,*，叶玉娥1，岳 鹏2，王 瑾2，胡必腾1

(1.合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009；2.安徽曦强乳业集团有限公司，安徽 淮北 235000)

以青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05为原料制备富硒酸奶发酵剂。在单因素试验基础上，采用Box-Behnken试验设计对青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05混合富硒条件进行优化，得到最佳富硒条件为低聚果糖1%、Se4+质量浓度6.83μg/mL、初始pH6.0、青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05接种比例2:1、接种量3.8%、培养温度42℃、培养24h加硒、培养时间60h。在上述条件下，青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05混合菌体含硒量为(551±4.6)μg/g，硒转化率为(42.2±3.6)%。利用青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05制备的富硒酸奶发酵剂具有良好的发酵性能，用其发酵制备富硒酸奶，其有机硒含量为(17±4.5)μg/kg。

青春双歧杆菌；干酪乳杆菌；富硒；酸奶

硒(Se)是人和动物机体必需的微量元素之一[1]，具有抗癌、防止克山病、抗氧化、延缓衰老、提高机体免疫力、改善心血管疾病、骨关节炎和重金属毒害等作用[1-2]。中国营养学会推荐正常人体硒摄入量为60～200μg/d，而我国13省市营养调查显示，硒日摄入量普遍不足，成人硒摄入量仅为26.36μg/d[3]。硒在形态上可分为有机硒和无机硒，有机硒较无机硒吸收利用率高且副作用小，因此将无机硒转化为有机硒，并以有机硒改善人体硒摄入量不足具有重要意义。学者们研究发现乳酸菌具有良好的富硒能力[4-5]，可作为有机硒的良好来源，对本实验室筛选保藏的多种益生菌株进行富硒试验，发现青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05具有较强的富硒能力。本实验在单因素试验基础上，用Box-Behnken试验对青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05混合富硒条件进行优化，并将其制备成富硒酸奶发酵剂发酵复原乳生产富硒酸奶。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青春双歧杆菌ys01、干酪乳杆菌ys05本实验室从市售酸奶中分离保藏；酸奶发酵剂Ⅰ 嘉吉亚太食品系统(北京)有限公司；酸奶发酵剂Ⅱ 北京川秀科技有限公司。

MRS培养基[6]；MRS改良培养基：于MRS培养基中添加0.05%半胱氨酸盐酸盐121℃灭菌15min；全脂乳培养基：复原乳92%、蔗糖6%、低聚异麦芽糖1%、酪蛋白酸钠1%、Na2SeO340μg/kg。

5.0 μg/mL硒标准溶液、5g/L 3,3-氨基联苯胺溶液、5g/L EDTA-2Na、2mol/L硝酸等(均为分析纯)。

1.2 仪器与设备

马弗炉；752型紫外-可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；NDJ-7型黏度计 厦门中村光学仪器厂；CO2培养箱 日本三洋公司；恒温培养箱 上海三发科学仪器有限公司；CT14RD型冷冻离心机 上海天美科学仪器有限公司；MWCO 3500透析袋 合肥博美科贸有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌体富硒和菌体含硒量测定

菌体富硒：将亚硒酸钠配成一定浓度的溶液，灭菌备用。将亚硒酸钠溶液按比例加入200mL改良MRS液体培养基中，摇匀，接入青春双歧杆菌ys01、干酪乳杆菌ys05及其混合菌悬液。37℃培养72h，然后将培养物在4℃、10000r/min条件下离心10min，弃上清液用去离子水洗涤3次，于60℃干燥至质量恒定。

菌体含硒量测定：菌体处理参考Sanchez-Segarra等[7]报道的方法进行，菌体含硒量用3,3-氨基联苯胺比色法[2]测定。

1.3.2 单因素试验和Box-Behnken试验设计优化菌体富硒条件

对青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05富硒进行单因素试验，考察硒质量浓度(3、6、9μg/mL)、加硒时间(0、8、16、24、32h)、培养时间(36、48、60、72、84h)、培养温度(37、39、41、42、43℃)、初始pH值(5.0、6.0、7.0)、接种比例(青春双歧杆菌ys01:干酪乳杆菌ys05=1:1、2:1、3:1、2:3、1:2)、接种量(菌悬液质量分数1%、3%、5%)、低聚糖及其含量(分别0%、0.5%、1%、1.5%的低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖、低聚异麦芽糖代替液体改良MRS培养基中等量葡萄糖)对菌体含硒量的影响，依据单因素试验结果，进行Box-Behnken试验，并进行验证实验。实验设3个重复取其平均值。用Design Expert 7.0软件对Box-Behnken试验结果进行多元回归拟合求解二次多项式模型Y=β0＋α1A＋β1B＋γ1C＋α1β1AB＋α1γ1AC＋β1γ1BC＋α11A2＋β11B2＋γ11C2，采用F检验对数据进行方差分析，评价二次多项式模型及其回归系数的显著性。

1.3.3 富硒发酵剂制备及其发酵性能测定

富硒发酵剂制备：将青春双歧杆菌ys01及干酪乳杆菌ys05混合富硒培养物置于50mL无菌离心管中在4℃，10000r/min条件下冷冻离心10min，用一定体积的复原乳(108℃灭菌20min)将菌体洗下并调整至适宜浓度(约4×108CFU/mL)即得酸奶发酵剂，按2%的接种量接于全脂乳培养基(市售酸奶发酵剂Ⅰ、Ⅱ分别为对照1和2)42℃发酵一定时间，于4℃冰箱中冷藏12h后测其发酵性能。

发酵性能测定：酸度、pH值和黏度参考甘伯中等[8]的方法测定；活菌数参考Tabasco等[6]的报道进行，每隔0.5h观察凝乳情况，记录凝乳时间，实验设3个重复，其结果以“平均值±标准偏差”表示。

1.3.4 富硒酸奶感官评价和理化指标测定

富硒酸奶感官品评和理化指标测定参考GB 19302—2010《食品安全国家标准：发酵乳》[9]进行。

富硒酸奶含硒量测定：取10g酸乳加入截留分子质量为3500D透析袋中，并置于去离子水中透析至无硒析出时，将酸奶在4℃、10000r/min条件下，离心10min，弃上清液用去离子水洗涤3次，60℃干燥至质量恒定。然后参考Sanchez-Segarra等[7]的方法(略作修改)，将样本于460℃的马弗炉中焚烧15h，冷却后灰分用2mL 2mol/L的硝酸漂白，然后在电炉上干燥并在460℃马弗炉中保持1h。以5mL 2mol/L的硝酸回收灰分，用0.1mol/L的硝酸定容至25mL，以3,3-氨基联苯胺比色法[2]测定硒含量。实验设3个重复，其结果以“平均值±标准偏差”表示。

2 结果与分析

2.1 菌体富硒条件单因素和Box-Behnken试验

单因素试验表明，适宜的富硒条件为硒质量浓度6μg/mL、培养24h时加硒、培养时间60h、培养温度42℃、初始pH6.0、青春双歧杆菌ys01:干酪乳杆菌ys05=2:1、接种量3%、低聚果糖1%。

参考单因素试验结果，选择接种量、硒质量浓度及pH值为主要影响因素，以菌体含硒量为指标进行Box-Behnken试验，试验设计及结果见表1。利用Design Expert 7.0对试验数据进行分析处理，结果如表2所示。对菌体含硒量的影响程度从大到小依次为接种量、硒质量浓度和p H值，回归方程为：

Y=543.80＋14.00A＋10.75B＋2.0C＋14.00AB＋19.00AC－20.50BC－45.40A2－29.90B2－24.90C2(1)

对二次多项式模型回归系数和试验结果进行方差分析(表2)，Fmodel＝78.34，概率Pmodel＜0.0001，表明方程(1)显著；失拟项概率Plose=0.2722＞0.05，即无失拟因素存在；决定系数R2=0.9902，说明方程(1)能较好地反映所选参数与响应值之间的真实关系[10]。此外，变异系数(CV)为1.15%＜5%即方程(1)具有良好的重现性[10]，R2Pred=0.9014与R2Adj=0.9775较好的吻合。根据方程(1)选其中两因素为变量，另一因素位于中心点作图1和2。由图1可见，无论是随着硒质量浓度的增加，还是随着接种量的增加，菌体含硒量均呈现先增加后减少的趋势。类似的随pH值增加，菌体含硒量也呈现同样的趋势(图2)。由表2可知，硒质量浓度、接种量和pH值3因素的交互项对菌体含硒量均具有极显著(PAB＜0.01，PBC＜0.01，PAC＜0.01)的影响。

表1 Box-Behnken试验设计与结果Table 1 Scheme and results of Box-Behnken design

表2 二次多项式模型回归系数估计和试验结果方差分析Table 2 Estimation of regression coefficients for the quadratic polynomial model and variance analysis of experimental results

图1 接种量和硒质量浓度交互作用响应面Fig.1 Response surface plot illustrating the interative effects of inoculation amount and selenium concentration on the content of selenium in yogurt

图2 硒质量浓度和初始pH值交互作用响应面Fig.2 Response surface plot illustrating the interative effects of selenium concentration and initial pH on the content of selenium in yogurt

此外，由图1、2还可以看出，方程(1)存在最大值点。利用方程(1)计算得到菌体最高含硒量为546.337 μg/g，此时接种量、硒质量质量浓度和pH值分别为3.79%、6.83μg/mL和6.02。在上述条件下进行验证实验，青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05混合菌体含硒量为(551±4.6)μg/g，硒转化率为(42.2±3.6)%。

2.2 富硒酸奶与发酵剂性能

表3 发酵剂的发酵性能(n=3)Table 3 Fermentation performance of yogurt starter (n=3)

以上述富硒发酵剂发酵复原乳制备富硒酸奶，发酵剂主要性能见表3，富硒酸奶发酵剂的凝乳时间(7.5±0.5)h，酸度、pH值、黏度和活菌数分别为(80±3)°T、(4.6±0.3)、(119±8)mPa·s和(4.0±0.3)×108CFU/mL，与市售酸奶发酵剂(对照1和2)相比，富硒酸奶发酵剂的酸度和黏度性能稍低，pH值、凝乳时间和活菌数基本一致，表明该酸奶发酵剂具有良好的发酵性能，可作为一种新型酸奶发酵剂使用。

2.3 富硒酸奶感官和理化指标

富硒酸奶的感官评价和理化指标见表4和5。富硒酸奶呈乳白色有光泽、奶香纯正、酸甜可口、组织细腻均一且无乳清析出(表4)。此外，富硒酸奶脂肪、非脂乳固体、蛋白质等主要理化指标(表5)均符合GB 19302—2010[9]的相关规定，其有机硒含量为(17±4.5)μg/kg。

表4 酸奶感官评价Table 4 Sensory evaluation of yogurt

表5 酸奶理化指标(n=3)Table 5 Physical and chemical indexes of yogurt (n=3)

3 结论与讨论

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计对青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05混合富硒条件进行优化，菌体含硒量回归方程：Y=543.80＋14.00A＋10.75B＋2.0C＋14.00AB＋19.00AC－20.50BC－45.40A2－29.90B2－24.90C2，其最佳富硒条件为改良MRS培养基中Se4+质量浓度6.83μg/mL、低聚果糖1%、初始pH6.0、青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05接种比例2:1、接种量3.8%、培养24h加硒、培养温度42℃、培养时间60h。在此条件下，青春双歧杆菌ys01和干酪乳杆菌ys05混合菌体含硒量(551±4.6)μg/g，硒转化率(42.2±3.6)%，与副干酪乳杆菌[4]相比菌体含硒量约提高144μg/g，较动物双歧杆菌01[5]硒转化率约提高14.1%，但较其菌体含硒量[(898±74)μg/g]低。

本研究制备的富硒酸奶发酵剂，具有良好的发酵性能，用其发酵复原乳制得有机硒含量(17±4.5)μg/kg的优质富硒酸奶。与魏小雁等[11]研制的直投式酸奶发酵剂相比，该富硒酸奶发酵剂有机硒含量高且发酵性能较好，但其酸度和黏度比市售酸奶发酵剂Ⅰ和Ⅱ稍低，原因可能是市售酸奶发酵剂中的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌产酸量高，同时其胞外多糖具有增稠和胶凝作用，因此增加了酸奶的黏度[11-13]。本研究制备的富硒酸奶，奶香纯正、酸甜可口、细腻均一，主要理化指标均符合GB 19302—2010[9]的相关规定，且富含有机硒，是补充有机硒的良好食源。本研究为富硒酸奶的工业化生产提供一定参考。

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Development and Fermentation Performance Evaluation of A Selenium-enriched Yogurt Starter and Evaluation

LIU Dong1，YE Ming1,*，YE Yu-e1，YUE Peng2，WANG Jin2，HU Bi-teng1
(1. College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China；2. Anhui Xiqiang Dairy Group Co. Ltd., Huaibei 235000, China)

Bifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 were used as the materials to prepare a seleniumenriched yogurt starter. The optimal conditions for selenium enrichment withBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 were explored by single-factor and Box-Behnken design methods. The optimal conditions for selenium enrichment were fructooligosaccharide of 1%, Se4+concentration of 6.83 μg/mL, initial pH 6.0, inoculation ratio betweenBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 of 2:1, inoculation amount of 3.8%, incubation temperature of 42 ℃, selenium addition time point at the 24 h of cultivation, and cultivation period of 60 h. Under the optimal conditions, the content of selenium in the mixture ofBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 was (551 ± 4.6)μg/g and the conversion rate of selenium was (42.2 ± 3.6)%. In addition, an excellent fermentation performance of selenium-enriched yogurt starter prepared byBifidobacterium adolescentisys01 andLactobacillus caseiys05 was achieved. The content of organic selenium in the yogurt prepared by this starter was (17 ± 4.5)μg/kg.

Bifidobacterium adolescentis；Lactobacillus casei；selenium enrichment；yogurt

TS252.54

A

1002-6630(2011)06-0076-04

2010-05-23

安徽省年度科研计划项目(09020303079)；安徽省产学研合作项目(09-92432227)

刘冬(1982—)，男，硕士研究生，研究方向为农产品加工与贮藏。E-mail：liudong1595693@163.com

*通信作者：叶明(1959—)，男，教授，博士，研究方向为微生物资源与应用。E-mail：yeming123@sina.com