黑木耳不同生长期栽培基质中营养成分变化研究*

王玉江，韩增华

（黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010）

黑木耳（Auricularia auricula）是我国广泛人工栽培的食用菌品种，黑龙江省栽培量大，约占总产量的60%[1]。黑木耳为腐生异养真菌，需吸收培养基质中的碳、氮营养来完成自身生长。黑木耳在培养的过程中会不断的吸收、分解培养料中的营养，以满足不同阶段的菌株生长[2]。本研究通过对菌丝生长阶段、后熟阶段和出耳芽阶段基质中的还原糖、多糖、总糖和可溶性蛋白含量变化的测定，找出各阶段各指标的变化情况，分析其在菌丝生长发育阶段和出耳前期的变化趋势，研究黑木耳生长不同时期的代谢调控和出耳芽机制，为黑木耳栽培管理提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

黑29（黑龙江省科学院微生物研究所菌种保藏中心提供）。

1.1.2 培养基

母种培养基：土豆200g（煮汁1000 mL），琼脂粉14.0g，葡萄糖 20.0g，磷酸二氢钾 3.0g，硫酸镁 1.5g，蛋白胨0.5g，维生素B110.0mg，pH自然。原种、栽培种培养基：木屑79%，麸皮20%，石膏1%，含水量为65%，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌种制作

原种和不同栽培种培养料分别装500mL葡萄糖玻璃瓶和15×31cm聚乙烯折角袋，原种每瓶装入培养料合干料约175g（湿重500g），栽培种每袋装入培养料合干料280g（湿重800g），121℃下灭菌90min，取1.5cm2的在母种培养基上活化菌种接种于原种培养料，25℃培养至菌丝发满。以1/50的接种量接入栽培种培养料中，25℃培养，40d长满袋，25℃继续培养至80d后熟，开12个1.5 cm×1.5cm“V”型口。

1.2.2 催耳芽管理

恒温恒湿培养箱催芽温度15～25℃，相对湿度85%～95%，光照 65～80Lx，CO2浓度 410～614 ppm。

1.2.3 取样时期

分别于菌种接种后的 20d、30d、40d、50d、60d、70d、80d、82d（割口第二天）、92d（耳线形成）、102d（现耳芽期取样）。

1.2.4 样品处理

将长满菌丝的样品打碎，混匀，放于105℃烘箱内烘干，小型粉碎机粉碎，过120目筛，继续烘干至恒重，为待测样品。

1.2.5 还原糖的测定[3]

准确称取0.5g不同培养时期的样品于试管中，加入15mL蒸馏水，50℃下恒温浸提20min，离心过滤，取全部滤液在25ml容量瓶中定容，3个重复。每个重复取l.0mL滤液，各加入2.0mL DNS，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入9.0mL蒸馏水，摇匀，540nm处测定光吸收值，从葡萄糖标准曲线上查出葡萄糖质量，计算样品中还原糖含量。

1.2.6 总糖的测定[3]

准确称取0.2g样品于试管中，加6.0mol/L的盐酸4.0mL和蒸馏水6.0mL，于沸水中煮30min，冷却后加1滴酚酞，6.0mol/L氢氧化钠中和至呈微红色，离心过滤后，在25mL容量瓶中定容，以下步骤同还原糖测定。

1.2.7 粗多糖含量测定[4]

1.2.7.1 样品提取 准确称取样品2.0g，置于100mL容量瓶中，加水80mL左右，于沸水浴上加热2h，冷却至室温后补加水至刻度，混匀，过滤。取样品滤液4.0mL置于50mL离心管中，加入无水乙醇16mL，混匀后，以4000r/min离心15min，弃去上清液,沉淀用乙醇溶液5.0mL洗涤，离心后弃去上清液，反复3～4次操作,自然晾干，加水2.0mL溶解多糖，为样品测定液。

1.2.7.2 测定 取样品测定液1.0mL置于25mL试管中，加入苯酚溶液1.0mL，混匀后，小心加入浓硫酸5.0mL，置于水浴中煮沸10min，冷却至室温,1cm比色皿490nm处分光光度计测定吸光度值，以水替代样品做空白对照，3个重复。从葡萄糖标准曲线上查出葡萄糖质量，计算样品中粗多糖含量。

l.2.8 可溶性蛋白质含量测定

准确称量样品0.lg，放研钵内加pH7.5磷酸盐缓冲液2.0mL研磨至糊状，再加入5.0mL缓冲液浸提30min，5000r/min离心，将上清液取出定容至25mL。取定容提取液1.0 mL于试管中，加入考马斯亮蓝5.0mL摇匀，分光光度计595nm下测定OD值，根据所测定的OD值，结合标准曲线回归方程计算提取液的蛋白质浓度和样品的蛋白质含量，实验设3个重复。

2 结 果

2.1 不同生长期基质中还原糖含量变化

从图1看出：还原糖含量在菌丝生长期、菌丝后熟期、开孔期一直呈下降趋势，培养20d（菌丝峰顶至生长至1/5高度）还原糖含量最高，达5.72mg/g干物质，在菌丝生长20d后至后熟期还原糖含量逐渐下降，至开口时基质中还原糖降至0.22 mg/g干物质，之后还原糖开始急剧增加，且增加幅度较快。

图1 不同生长期培养基质中还原糖含量Fig.1 Reducing sugar content in different growth culture media

2.2 不同生长期基质中总糖含量变化

总糖含量变化见图2。

图2 不同生长期培养基质中总糖含量Fig.2 Total sugar content in different growth culture media

在不同生长期内总糖含量变化相对较小，含量较高的时期为培养的20d，含量为289.4 mg/g干物质，含量较低的时期为开孔第2d，含量为183.6 mg/g干物质。菌丝生长期内（40d内）含量逐渐下降，后熟前期（40～60d）总糖含量有小幅增加，后熟后期（60～80d）至开孔期稍有下降，并维持一定水平，开孔后至出耳线多糖含量再次升高，至出耳芽时又有所下降。后熟期、催耳芽期总糖含量变化幅度不大，呈小幅度升高、下降，并一直维持相对较高的含量水平。

2.3 不同生长期基质中多糖含量变化

多糖含量变化见图3，在整个生长期及催耳期多糖含量变化幅度较大。菌丝培养前期（前30d），培养基质中的多糖含量迅速下降，之后有所回升，此时是黑木耳菌丝旺盛生长期。后熟期（40～80d）多糖含量迅速降至较低水平，至开孔后多糖含量迅速升高，至出耳线期升至较高水平，之后再次下降。

图3 不同生长期培养基质中多糖含量Fig.3 Polysaccharide content in different growth culture media

2.4 不同生长期基质中可溶性蛋白质含量变化

可溶性蛋白质在菌丝生长期及后熟期含量相对较低（图4），在耳线形成期达到最高，含量为2.73 mg/g干物质。菌丝生长的前30d，呈下降趋势，至40d有所升高，之后在后熟期内维持较低的水平，开孔后，基质中的可溶性蛋白质升高幅度较快，至出耳芽时稍有下降。

图4 不同生长期培养基质中可溶性蛋白含量Fig.4 Soluble protein content in different growth culture media

3 讨 论

不同时期基质中营养物质变化表明，菌丝在不同时期生长消耗和代谢的营养物质有差异[5]。菌丝前期旺盛生长时，会迅速消耗基质中的营养物质，同时菌丝中积累的营养物质还不够充分，此时表现为各营养物质的消耗下降[6]。其中多糖、还原糖在菌丝生长期和后熟期一直呈下降趋势，表现为营养生长期的生长消耗，而在开孔后这两种物质在培养基中的积累量迅速增加，直至出耳芽时再次下降。可溶性蛋白质和总糖的变化趋势大致相同，菌丝生长初期含量有所下降，至积温期有小幅的升高并维持一定的含量，开口后两种营养物质在基质中又迅速积累至较高浓度，出耳期各营养物质再次下降。由上述变化分析可知，黑木耳菌丝生长期及后熟期菌丝生长需消耗培养基质中的营养物质，同时菌丝生长会积累一定的营养物质。当基质中营养物质含量表现为下降时，则消耗大于积累，消耗大时表现为菌丝生长。可溶性蛋白质和总糖的含量在菌丝生长的积温期有增长趋势，而多糖、还原糖则有所下降，此时菌丝生长代谢均表现出相对稳定的水平，并维持这一水平，此时并未表现出各营养物质的大量积累。营养物质的迅速积累发生在菌袋开孔后，这表明，开孔可刺激黑木耳出耳前期营养物质的积累。研究黑木耳不同生长期营养成分的变化规律，了解不同时期营养积累，为黑木耳催芽及后期出耳提供有效的理论依据。

∶

[1]陈士瑜.食用菌生产大全[M］.北京：中国农业出版社，1988.

[2]扬新美.中国食用菌栽培学[M］.北京：中国农业出版社，1988.

[3]丛峰松.生物化学实验[M］.上海：上海交通大学出版社，2005.

[4]陶美华，潘清灵，章卫民.药用真菌多糖含量测定方法研究[J］.中国食用菌，2005，24（5）：37～38.

[5]冯志勇，潘迎杰，陈明杰，等.香菇发育生理研究进展[J］.食用菌学报，2000，7（4）：53～60.

[6]高君辉，冯志勇，唐利华.杏鲍菇培养阶段基质理化特性变化的研究[J］.上海农业学报，2009，25（4）：82～84.