黄芪当归配伍对气道变应性炎症大鼠Th1/Th2平衡的影响

袁颖，郭忻 ，符胜光

气道变应性炎症（allergic airway inf l ammation）是指气道由变应原诱发的炎症反应。常见的具有气道变应性炎症的疾病主要有变应性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)和哮喘（asthma）。AR属于上气道变应性疾病，哮喘属于下气道变应性疾病。气道变应性炎症反应属于Ⅰ型变态反应，Th1/Th2细胞因子平衡失调，Th2类细胞因子增多，功能增强是气道变应性炎症发生发展的重要因素[1]。黄芪和当归临床常用于气道变应性疾病的治疗。本研究在建立气道变应性炎症的基础上，以Th1、Th2的代表性细胞因子IFN-γ、IL-4为指标，探讨了黄芪当归配伍对气道变应性炎症大鼠Th1/Th2的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 健康SD大鼠，清洁级，雄性，48只，体重120±10 g。分笼饲养于上海中医药大学动物实验中心SPF级动物实验室内。随机分为6组，每组8只。分别为空白对照组、模型对照组、黄芪组、当归组、芪归配伍组、阳性对照组。

1.1.2 实验试剂 OVA（Ⅴ级）：sigma公司。氢氧化铝凝胶：sigma公司。一抗：购于美国Santa Cruz公司。EnVision试剂(HRP/Rabbit) 即用型购于丹麦Dako。IL-4大鼠ELISA试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司。IFN-γ大鼠ELISA试剂盒：invitrogen。

1.1.3 实验用药 黄芪：豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. vsr. mongholicus (Bge.)Hsiao.的干燥根。产地：甘肃。批号：091211

当归：伞形科植物当归 Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。产地：甘肃。批号：091128

阳性对照药：曲尼斯特胶囊，中国药大制药，批号：20070915。

1.1.4 主要仪器 402A超声雾化器：江苏鱼跃医疗设备有限公司。IMS细胞图象分析系统（医学图象分析软件）：上海申腾信息技术有限公司。酶标仪：BIO-TEK ELX800。

1.2 实验方法

1.2.1 造模方法

①致敏阶段 于实验d1、d8，除空白对照组给予氢氧化铝凝胶，各组动物均以新鲜配制的1mgmL-1OVA氢氧化铝凝胶致敏液作皮下注射，每鼠在两侧后足跖、腹股沟、腰、背、颈部共取10点，每点注射0.05 mL，同时腹腔注射0.5 mL，共计1 mL。

②激发阶段 于实验d 15～d 36，将大鼠置于自制雾化箱内，用超声雾化器以校定的雾化量0.8mL/min/箱，雾化1%OVA激发液15 min，每日1次，以激发气道变应性炎症。空白对照组雾化以生理盐水。观察激发后动物鼻部症状及呼吸变化。

1.2.2 给药方法 黄芪水煎液、当归水煎液、黄芪＋当归（1∶1）水煎液，按10g（生药）/kg（体重）灌胃给药，每日1次。空白对照组和模型对照组灌胃给予等体积的生理盐水。阳性药组给予曲尼斯特，34 mgkg-1。

1.2.3 取材处理 最后一次激发后24 h后，用25%乌拉坦（按4mLkg-1体重）进行腹腔麻醉。迅速打开腹腔，腹主动脉取血10 mL。迅速开胸，取出肺组织，浸泡于10%中性甲醛缓冲液中固定。取下动物双侧鼻腔鼻黏膜，迅速放入10%中性甲醛溶液中。

1.2.4 免疫组化方法 参照丹麦 Dako公司免疫组化试剂盒Envision 系统操作说明。

常规4μm石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58℃烤18 h，常规二甲苯脱蜡至水；0.01 molL-1PBS（PH 7.4）洗3×3 min；用pH6.0 0.01M CB 热诱导修复20 min，室温自然冷却，PBS洗3×3 min；0.3%H2O2抑制内源性过氧化物酶20 min，室温；PBS洗3×3 min；20%正常羊血清室温孵育30 min, 不洗；滴加一抗37℃孵育 2h；PBS洗3×3 min；EnVision试剂(HRP/R)37℃ 30min；PBS洗3×3 min；DAB显色8～12 min；苏木素衬染色，热水蓝化；吹干后，树脂封片；镜下观察，阳性产物呈棕黄色或黄色。每张切片分析3个视野，以高清晰度图文分析系统测定免疫组化图像中阳性细胞区域面积。

1.2.5 ELISA检测方法 根据ELISA试剂盒说明书操作。酶标仪450nm检测。

1.2.6 统计学处理 数据采用均数±标准差（x±SD）表示，组间比较采用方差齐性检验及单因素方差分析。统计分析采用SPSS 11.0 for Windows软件包完成。

2 实验结果：

2.1 黄芪当归配伍对鼻黏膜IFN-γ、IL-4表达的影响

结果见表1。

表1 黄芪当归配伍对鼻黏膜IFN-γ、IL-4表达的影响(x¯±SD，n=8)

表1结果表明：鼻黏膜IFN-γ表达，除黄芪组与模型对照组比较差异有统计学统计学意义外（P<0.05），其余各组之间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。鼻黏膜IL-4表达，模型组与空白对照组相比，IL-4表达增加（P<0.01）。当归组、芪归配伍组和阳性对照组，IL-4表达与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01）。IFN-γ/ IL-4比值：模型组与空白对照组相比，IFN-γ/ IL-4表达降低（P<0.01）。当归组、芪归配伍组和阳性对照组，IFN-γ/ IL-4与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01）。

2.2 黄芪当归配伍对肺组织IFN-γ、IL-4表达的影响

结果见表2。

表2 黄芪当归配伍对肺组织IFN-γ、IL-4表达的影响(x¯±SD，n=8)

表2结果表明：肺组织IFN-γ表达，模型组与空白对照组相比IFN-γ表达降低（P<0.01）。芪归配伍组IFN-γ表达与模型组相比差异有统计学意义（P<0.05）。肺组织IL-4表达：模型组IL-4表达升高，各给药组表达与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。肺组织IFN-γ/ IL-4比值，模型组与空白对照组相比IFN-γ/ IL-4降低（P<0.01），黄芪组、芪归配伍组及阳性对照组与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。

2.3 黄芪当归配伍对血清IFN-γ、IL-4含量的影响

结果见表3。

表3 黄芪当归配伍对血清IFN-γ、IL-4含量的影响((x¯±SD，n=8)

表3结果表明：血清IFN-γ含量，模型组与空白对照组相比IFN-γ含量降低（P<0.05）。黄芪组和芪归配伍组IFN-γ含量与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01）。血清IL-4含量：模型组IL-4含量升高，各给药组表达与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。血清IFN-γ/ IL-4比值，模型组与空白对照组相比IFN-γ/ IL-4降低（P<0.01），黄芪组、芪归配伍组及阳性对照组与模型组相比差异有统计学意义（P<0.01或P<0.05）。

2.4 鼻与肺之间IL-4、IFN-γ的相关性分析

结果见表4。

表4 鼻黏膜及肺组织中IFN-γ、IL-4表达的相关性分析

表4结果显示，鼻与肺之间IL-4、IFN-γ呈正相关性（P<0.01）。

3 讨论

Thl和Th2细胞在机体免疫中发挥不同的作用。Th1细胞主要反映的是细胞免疫，Th1细胞占优势时，表现促炎为主，具有清除多种致病原的作用，主要抑制感染的发展，有助于病情康复或慢性感染的建立[2]；Th2细胞主要反映的是体液免疫，Th2细胞占优势时，表现抗炎为主，产生各种病理产物，倾向于引起严重的病理改变。而在气道变应性炎症中，Thl/Th2平衡向着Th2细胞方向漂移。只有当Thl／Th2处于动态平衡时，机体才处于健康状态。Th1／Th2平衡调节也可认为是阴阳平衡调节的一个方面[3]。

血为气之母，气为血之帅。黄芪当归药对的配伍原则为气血同治，为临床所常用，以《内外伤辨惑论》当归补血汤为代表。芪归药对既能自成一方，又可作为基础药对配伍组方，因而备受历代医家重视。而黄芪和当归也常用于气道变应性疾病的治疗。如已有的药理研究证实，黄芪能活化T细胞，诱生IFN-γ、CSFs及增强淋巴因子激活的杀伤细胞活性等，表现出于其增强机体免疫有关的固有补气作用。黄芪可以增强下丘脑一垂体一肾上腺皮质功能，调节变Th1和Th2型细胞因子的平衡[4]～[5]，能改善哮喘患者的通气功能，降低气道高反应性[6]。

本研究结果显示模型组鼻黏膜、肺组织及血中IFN-γ降低、IL-4升高，且鼻黏膜与肺组织中相应指标具有一定相关性。单味黄芪可升高血及鼻黏膜中IFN-γ，降低血及肺中IL-4；单味当归可降低血、鼻黏膜及肺组织IL-4；黄芪当归配伍可升高血及肺组织IFN-γ，降低血、鼻黏膜及肺IL-4。提示黄芪当归配伍可调节气道变应性炎症中局部及全身Th1/Th2细胞因子平衡，抑制Th2类细胞因子、促进Th1类细胞因子，使平衡向Th1方向逆转，从而对气道变应性炎症有抑制作用。

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[4] 赵福东,董竞成,谢瑾玉,等.补肾、益气中药对哮喘模型大鼠神经内分泌免疫网络若干指标的影响[J].中国中西医结合杂志,2007,27(8):715.

[5] 张薇,赵菲.黄芪对儿童变应性鼻炎血清Th1／Th2的影响[J].中国药物与临床,2006,6(9):680.

[6] 张洁,孙秀珍,田蓉,等.黄芪对哮喘患者气道反应性的影响[J].第四军医大学学报,2006,27(8):701.