转化生长因子β2(TGF-β2)在老年性白内障与正常晶状体上皮细胞中mRNA表达的差异

李桂荣,周鸿雁,张文松*

(1.吉林大学第二医院眼科医院,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院眼科)

晶状体上皮细胞的异常增生、分化及凋亡是白内障发生的机制之一。国外有研究表明,生长因子、尤其是转化生长因子(TGF-β)在白内障发生过程中起着重要的作用[1]。本研究将TGF-β2在老年性白内障与正常晶状体上皮细胞中mRNA表达进行比较,以探讨TGF-β2在老年性白内障的形成及发展中作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 实验组为北京朝阳医院2005年老年性白内障患者白内障超声乳化术中所得的晶状体前囊膜。共42例,均为不同年龄的老年性白内障,男26例,女16例,平均年龄为63.4岁±8.2岁,对照组为健康成年眼球晶状体的前囊膜,共15例,为青壮年。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒;RT-PCR试剂盒;dNTPs(10mM);Taq 酶(2 U/μ l);β-Actin(25 pmol/μ l),均为北京鼎国生物技术有限公司的产品。

1.1.3 引物 从PUBMED/Nucleotide GenBank中查出人TGF-β2基因序列,β-actin序列作为内参照。应用Primer Premier 5.0设计引物。

引物由北京奥科生物公司合成。引物的序列如下 :TGF-β2:上游引物 5′-ACGGGGCGGGGCGGTGGA-3;下游引物 5′-CCGACCCTCCTCCTTCAC-3′,片段长度 :220 bp。β-actin:上游引物 5′-ATCCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′;下游引物 5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′,片段长度:552 bp。

1.2 方法

1.2.1 cDNA的合成 提取两组晶状体前囊膜中总RNA,并以此逆转录成cDNA。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 以β-actin作为内参,将其与待测得目的基因同时扩增,分两管相同体系进行。按试剂盒说明书操作。

1.2.3 琼脂糖电泳 分别取两管反应管中5 μ l扩增产物和上样缓冲液0.3 μ l点样后90 V电泳1 h,凝胶用紫外凝胶成像系统观察,并进行半定量分析。图像分析仪测照片上扩增产物的平均灰度,计算出其基因表达量与其对应的内参β-actin表达量的比值。

1.2.4 统计学处理 应用SPSS11.0软件包进行统计分析,各组两两比较采用方差分析,取 P＜0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 TGF-β2在老年性白内障与正常晶状体上皮细胞中mRNA PCR扩增产物

结果如图1所示:条带552 bp处为PCR阳性内参β-actin基因mRNA的扩增产物,条带220 bp处为TGF-β2mRNA的扩增产物。图a为老年性白内障组晶状体上皮细胞的TGF-β2基因的扩增产物,图b为正常对照组晶状体上皮细胞的TGF-β2基因的扩增产物。

图1 TGF-β2在老年性白内障与正常晶状体上皮细胞中mRNA PCR扩增产物

2.2 TGF-β2在老年性白内障与正常晶状体上皮细胞中mRNA表达的差异

图像分析仪检测琼脂糖凝胶上TGF-β2扩增产物的平均灰度,其基因表达量与其对应的β-actin表达量的比值,老年性白内障组为0.37±0.06,正常对照组为0.26±0.06,两组比较差异有显著性(P＜0.01)。

3 讨论

研究表明,在老年性白内障发生过程中最早发生的是晶状体上皮的损害。并且在白内障形成时晶状体上皮细胞发生多种退行性及增殖性改变。老年性白内障晶状体上皮细胞改变最终是以细胞凋亡为主[2]。而晶状体是没有血液供应的器官,晶状体上皮细胞的增殖、分化和凋亡主要依靠细胞外的基质、细胞因子、细胞密度等来调控。

TGF-β是一类人体大多数细胞都能够分泌的细胞因子,它是一种调节细胞生长和分化的多肽。在体内广泛存在。哺乳动物有三种亚型:TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。其中TGF-β2主要存在于眼内,其它组织中几乎不含TGF-β2[3]。TGF-β2具有双向细胞分裂调节的功能,它一方面促进人及动物晶状体上皮细胞增殖,分化和成熟;另一方面又具有抑制细胞增殖的作用[4]。TGF-β2还可诱导晶状体上皮细胞发生凋亡。TGF-β2可以引起体外培养的晶体上皮细胞发生白内障样损害,并且这种损害可以被抗体所阻断[5]。这就提示了TGF-β2在白内障的发生中起到了某种作用。

本研究结果显示,老年性白内障组的晶状体上皮细胞中TGF-β2基因扩增产物的平均灰度,其基因表达量与其对应的β-actin表达量的比值为0.37±0.06,正常对照组为0.26±0.06,两组比较差异有显著性(P＜0.01)。提示TGF-β2可能参与了老年性白内障晶状体上皮细胞的凋亡,从而对老年性白内障的发生起着一定的作用。TGF-β2因子对晶状体上皮细胞的调节还需进一步的进行研究。以期为将来预防和治疗老年性白内障提供一条新的途径。

[1]Li WC,Kuszak JR,Dunn K,et al.Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals[J].J Cell Biol,1995,130(1):169.

[2]蔡小军,杨桂芳,陈贵芹.老年核性及皮质性白内障晶体上皮细胞密度及增殖细胞核抗原的表达[J].湖北医科大学学报,2000,21:333.

[3]Ohta K,Yamagami S,Taylor AW,et al.IL-6 antagonizes TGF-beta and abolishes immune privilege in eyeswith endotoxin-induced uveitis[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2000,41:2591.

[4]Sun JK,Iwata T,Ziglel JS,et al.Differential gene expression in male and female rat lenses undergoing cataract induction by TGF-β[J].Exp Eye Res,2000,70(2):169.

[5]Hales AM,Chamberlain CG,McAvoy JW.et al.Cataract induction in lensescultured with transforming growth factor-beta[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1995,36:1709.