种间转移扩增法筛选长爪沙鼠微卫星位点

谭元卿，李 薇，杜小燕，路 静，吴艳花，王 超，陈振文

(首都医科大学基础医学院实验动物学系，北京 100069)

种间转移扩增法筛选长爪沙鼠微卫星位点

谭元卿，李 薇，杜小燕，路 静，吴艳花，王 超，陈振文

(首都医科大学基础医学院实验动物学系，北京 100069)

目的 筛选长爪沙鼠新的微卫星位点，为长爪沙鼠遗传分析提供遗传标记物。方法 从GenBank中随机选取小鼠微卫星位点引物536对，用这些引物对长爪沙鼠基因组DNA扩增，将阳性目的条带进行序列分析，找出符合微卫星序列特征的短串联重复序列。结果 536对小鼠微卫星引物在长爪沙鼠基因组中扩增出了313个阳性条带，经序列分析，确定130个长爪沙鼠微卫星位点;其中完美型位点占80.77%(105/130)，不完美型位点占19.23%(25/130)，与小鼠同源性为 24.3%(130/536)。将筛选出的微卫星位点在 GenBank中注册，注册号从GU562694到GU562823。结论 小鼠和沙鼠的微卫星位点具有较高的同源性，用小鼠的微卫星位点引物直接扩增长爪沙鼠基因组DNA可有效地筛选出长爪沙鼠微卫星位点。

小鼠;长爪沙鼠;微卫星;种间转移扩增

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：清洁级长爪沙鼠22只，性别不限，体质量49～85 g，由首都医科大学实验动物部提供【SCXK(京)2000-0012】，用于提取基因组DNA。

1.1.2 仪器：琼脂糖凝胶电泳仪(北京六一仪器厂);3K18高速冷冻离心机(Sigma公司，USA);超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司);PCR仪(PTC-200 Peltier Thermal cycle，Bio-Rad公司，USA)。

1.1.3 试剂：蛋白酶 K(Merck公司产品);低熔点琼脂糖(Promega公司产品);50bp DNA step ladder marker、Taq DNA聚合酶及 dNTP(大连宝生物工程有限公司，中国);克隆测序由北京鼎国生物技术有限责任公司完成。

1.2 方法

1.2.1 微卫星的筛选：从GenBank中随机挑选536个小鼠的微卫星位点引物序列进行合成，这些位点随机地分布于小鼠的常染色体和X染色体。

1.2.2 样本DNA的准备：称取0.1 g肾脏组织，剪碎放入盛有2 mL STE缓冲液的离心管中，然后加入蛋白酶 K(0.02 mg/mL)，55℃水浴消化12 h。随后采用酚-氯仿萃取法提取 DNA，用无水冰乙醇沉淀，空气中干燥后用TE液溶解。DNA浓度用分光光度计(Bio-Rad 680，USA)测定，并进一步用琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 PCR 扩增：反应体系为 30 μL，其中：10 ×buffer 3.0 μL;Mg2+浓度分别设置为 3.5、3.0、2.5、2.0 和 1.5 mmol/L;10 mmol/L dNTP 1.5 μL;10 μmol/L 上、下游引物各 1.5 μL;样品 DNA 1.8 μL(约60 ng);5U的 Taq酶 0.3 μL;用超纯水将体系补到30 μL。扩增条件：①预变性95℃ 5 min;②变性94℃ 30 s;③退火温度梯度：47～60℃ 30 s，④延伸72℃ 30 s;② ～④35个循环;⑤最后 72℃延伸7 min。

1.2.4 PCR产物处理： 取少量产物加样于1.5%的琼脂糖凝胶(加有适量的EB替代物)中电泳，挑选扩增产物在80～700 bp之间的条带测序，根据文献定义［6］确定是否为微卫星位点并进行归类分析。

2 结果

2.1 PCR扩增和序列分析

随机挑选的536对小鼠的微卫星位点引物，通过对22只沙鼠基因组DNA进行PCR扩增得到313(58.39%)个阳性条带(图1)。对这313个PCR阳性产物进行序列分析后，筛选到了130个符合微卫星条件(图2)的长爪沙鼠微卫星位点。将这些位点在GenBank上注册，相应的注册号见表1。从这些位点的类型分析中发现，有105个微卫星位点属于完美型位点，占80.77%;其他类型位点为25个，占19.23%。在130个长爪沙鼠微卫星位点中，有69个位点的等位基因大小为200～300 bp，占53.1%(表 2)。

2.2 长爪沙鼠微卫星位点的类型分析

将这130个位点的重复单位进行了归类分析结果表明：在单核苷酸重复的29个位点中，(A)n有14个，(T)n占13个，(A)n和(T)n之和占93.1%(27/29);二核苷酸的微卫星数量是39个，占所有类型的30%(39/130)，主要以(AC)n和(CA)n为主，其余见表3。

3 讨论

由于微卫星在基因组中广泛分布，具有良好的特异性和易于检测，使其成为生物遗传图谱的构建、群体遗传结构分析、物种遗传多样性的鉴定、个体识别等方面研究的重要遗传标记之一。常见的微卫星位点获得方法包括：1、从公共数据库中查找微卫星位点;2、从基因组DNA中筛选微卫星位点;3、遗传距离相近的物种间引物转移扩增。在上述的三种方法中，最简单省时的方法是从各个数据库中查找微卫星位点。如：Liu等［7］从大麦基因组文库中筛选了45个微卫星标记，并在大麦染色体上作图;Cho［8］从水稻基因组中查到194个微卫星标记。但该方法仅限于已有序列数据发布的物种。绝大多数微卫星位点是从小于1000bp的小插入片段基因组文库中通过寡核苷酸探针杂交获得的，魏东旺［9］从鲤鱼基因组 DNA中筛选微卫星位点时，用探针(CA)n对构建的文库杂交筛选，得到了22个微卫星位点。但该方法效率很低，为了提高微卫星位点分离的效率，研究者们常常采用引物法富集微卫星、杂交法富集微卫星以及RAPD富集法等筛选微卫星。富集法需要昂贵的实验设备来进行杂交检测，同时需要花费较多的研究经费，这些在一定程度上限制了其使用。由于微卫星侧翼序列在物种间具有保守性，所以一个物种的微卫星引物可以用来检测相近物种同源位点的多态性。Roy等［1］用狗的微卫星引物研究狼的遗传分化和杂交;Primmer和 Ellegren［11］描述了微卫星在6亿年前就分开的两个鸟类中的保守性;家牛和马的微卫星引物也分别被用来研究非洲水牛和加泰罗尼亚驴的遗传变化和种群结构［12，13］。

用种间引物转移扩增方法来筛选物种新的微卫星位点，常常需要改变扩增条件来实现其在物种间的通用性，甚至用测序和杂交等方法来进一步确定是否是微卫星，如赵太云等［14］用该方法在小鼠和长爪沙鼠间进行了初步尝试，通过优化扩增条件的方法用小鼠的微卫星引物在长爪沙鼠基因组DNA中筛选到了阳性条带，但遗憾的是没有进行序列分析，尚不能确定为微卫星位点。

图1 小鼠微卫星位点D3Mit130的引物在沙鼠中PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplification in the gerbil genome by mouse primers of loci D3Mit130

图2 小鼠位点D3Mit268的引物在沙鼠基因组DNA上PCR扩增产物的测序图Fig.2 The sequence map of discrete PCR products of the gerbil genome generated at the loci D3Mit268 by mouse-derived primers

表2 新筛选的长爪沙鼠微卫星位点的类型及产物大小Tab.2 Classes and product size of the new screened gerbil microsatellite loci

我们用小鼠的536微卫星位点，在沙鼠的基因组上成功的扩增出313条带，经测序得到了130个微卫星位点的序列，其阳性率为24.3%。但与其他报道相比，阳性率较低，例如 deGortari等［15］在 1997年用牛族位点引物在绵羊基因组上的扩增阳性率为58%(605/1036)，Huang 等［16］在 2005 年用鸭的微卫星位点在鹅的基因组上扩增也得到了50%(14/28)的阳性率，究其原因可能有以下几个方面：①公司测序时，有些条带在克隆或测序时出现了失误，而导致确定微卫星位点时比实际数量偏少;②同时在300 bp以上的条带中，经常有几种类型的核心序列，如按照混合型的位点计算，则与混合型微卫星位点的要求不符，但按两个位点来设计引物就是微卫星位点;③上面提到的其他物种筛选微卫星位点都是在同一属的不同种动物间筛选，它们之间有很近的亲缘关系。而小鼠与沙鼠只是属于同科，遗传分类上分属不同的种属，亲缘关系较远，因而同源性相对较低。

通过536个位点引物的PCR扩增，经测序确定了130个简单序列重复位点，其中完美型的位点为105个(80.77%)，有69个位点的大小在200～300 bp之间。这些位点为长爪沙鼠基因组的遗传分析和生物学特性基础研究奠定了基础，特别是为构建遗传连锁图谱，生物的多样性分析、基因漂流以及亲缘关系等方面研究提供了有力工具;也为我们今后将要开展的长爪沙鼠脑缺血模型群体的培育及相关性状的QTL研究提供了工具。从本实验结果可以看出，用小鼠的微卫星位点引物对长爪沙鼠的基因组进行 PCR扩增，筛选微卫星位点是一种有效途径。

表3 长爪沙鼠微卫星位点重复单位核苷酸类型Tab.3 The type of nucleotide repeats of gerbil loci

［1］ Bartoszyk GD，Hamer M.The genetic animal model of reflex epilepsy in the Mongolian gerbil：differential efficacy of new anticonvulsive drugs and prototype antiepileptics［J］.Pharmacol Res Commun，1987，19(6)：429-440.

［2］ Hidiroglou N，Gilani GS，Long L，et al.The influence of dietary vitamin E，fat，and methionine on blood cholesterol profile homocysteine levels，and oxidizability of low density lipoprotein in the gerbil［J］.Nutr Biochem，2004，15(12)：730-740.

［3］ 崔美芝，刘恩重，柳英侠.长爪沙鼠在医学研究中的应用［J］. 哈尔滨医科大学学报，1996，32(2)：205-206.

［4］ 李志东，刘忠华，陈美才，等.小鼠、大鼠、豚鼠和沙鼠对禽流感病毒致病敏感性的比较初报［J］.中国实验动物学报，2004，12(4)：212-216.

［5 ］ Neumann K，Maak S，Stuenner IW，et al.Low microsatellite variation in laboratory gerbils［J］.J Hered，2001，92(1)：71-74.

［6］ Chambers GK，MacAvoy ES.Microsatellites：consensus and controversy［J］.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol.2000，126(4)：455-476.

［7］ Lui ZW，Biyashev RM，Saghai Maroof MA.Development of simple sequence repeats DNA markers and their integration into a hardly linkage map［J］，Theor Appl Genet，1996，93：869-876.

［8］ Cho YG，Iahii T.Diversity of microsallite derived from genetic libraries and Genbank sequence in rice(Oryza sativa L)［J］.Theore Appl Genet，2000，100：713-722.

［9］ 魏东旺，楼允东，孙效文，等.鲤鱼微卫星分子标记的筛选［J］. 动物学研究，2001，22(3)：238-241.

［10］ Roy M S，Geffen E.Pattern of differentiation and hybridization in North American wolflike canids，recalled by analysis of microsatellite loci［J］.Mol Biol Evolution，1994，11：553-570.

［11］ Primmer C R，Ellegren H.Patterns of molecular evolution in avain microsatellites［J］，Mol Biol Evolution，1998，15：997-1008.

［12］ Simonsen BT，Siegimund HR，Arctander P.Population structure of African buffalo inferred from mtDNA sequences and microsatellite loci： high variation but low differentiation［J］.Mol Ecol，1998，7：225-237.

［13］ Jordana J，Folch P，Sanchez A，.Genetic variation(protein markers and microsatellites)in endangered Catalonian donkeys［J］.Biochem Syst Ecol，1999，27：791-798.

［14］ 赵太云，路 静，陈振文，等.大、小鼠微卫星引物对长爪沙鼠的扩增［J］.中国比较医学杂志，2006，16(2)：114-117.

［15］ deGortari MJ，Freking BA，Kappes SM，et al.Extensive genomic conservation of cattle microsatellite heterozygosity in sheep［J］.Anim Genet.1997，28：274-290.

［16］ Huang YH，Tu JF，Cheng XB，et al.Characterization of 35 novel microsatellite DNA markers from the duck(Anas platyrhynchos)genome and cross-amplification in other birds［J］.Genet Select Evol.2005，37：455-472.

Screening of novel microsatellite DNA markers in Mongolian gerbils by cross-amplification

TAN Yuan-qing，LI Wei，DU Xiao-yan，LU Jing，WU Yan-hua，WANG Chao，CHEN Zhen-wen*
(Department of Laboratory Animal Sciences，Capital Medical University，Beijing 100069，China)

Objective To screen new microsatellite loci in Mongolian gerbils to develop genetic markers for genetic analysis.Methods 536 mouse loci were randomly selected from GenBank and amplified in Mongolian gerbils genetic DNA.The positive PCR products were sequenced and confirmed as simple sequence repeat(SSR)loci.Result Of these 536 mouse markers，313(58.39%)were discretely amplified from the laboratory gerbils.Of these 313 sequenced markers，130 were confirmed as SSR loci in the gerbil，in which 105 loci(80.77%)were classified as pure，and 25 loci(19.23%)as unpure.The homology orthologous between mouse and gerbil is about 24.3%(130/536)，and the access number of loci in GenBank is from GU562694 to GU562823.Conclusions There are comparatively high homology between mouse and gerbil，and cross-amplification by mouse microsatellite primers is an efficient way to identify gerbil SSR loci.

Mouse;Mongolian gerbil;Microsatellite;Cross-amplification

Q95-33

A

1005-4847(2011)01-0001-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.001

长爪沙鼠被誉为“多能性”实验动物，在生命科学诸多领域已得到广泛应用［1-4］。但由于对长爪沙鼠的基础研究相对薄弱，尤其是遗传学基础研究开展的甚少，致使对长爪沙鼠生物学特性及应用研究不够深入。找到更多的遗传标记物是开展长爪沙鼠遗传研究的基础和条件，而微卫星由于在基因组中分布广泛、信息含量大、结果稳定可靠、易于鉴定及简单的遗传方式等特点，使其成为一种极好的分子标记体系，应用其对个体基因组分析后，可以得到丰富的多态性信息和数据，目前已广泛地应用于各种生物的基因定位、连锁分析，群体遗传结构分析和标记辅助选择等方面的研究。但长爪沙鼠的微卫星位点报道较少，仅有Neumann等［5］在2001年筛选的9个微卫星位点。根据微卫星引物在不同种动物间有保守性原理，我们采用了种间转移扩增法——用小鼠的微卫星引物筛选长爪沙鼠微卫星位点，为建立长爪沙鼠微卫星位点遗传数据库积累数据。

国家自然科学基金项目(No.30570261);国家科技支撑计划课题(No.2009BAI83B02);北京市教委重点项目(No.KZ200910025002)。

谭元卿，(1983-)，男，硕士研究生，研究方向：实验动物分子遗传学。

陈振文(1959-)，男，博士，教授，主要从事实验动物教学与科研工作。Email：czwen@sohu.com

2010-10-12