黏度法测定麦冬多糖酶法降解产物的相对分子质量

孙 秀 艳, 韩 祥, 金 凤 夑, 鱼 红 闪

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

本实验室在前期工作中得到Absidiasp. O84s菌种所产的酶,此酶可水解麦冬多糖得到低聚合度的多糖,运用黏度计法测定麦冬多糖和麦冬多糖酶解产物的相对分子质量。黏度法测定高分子溶液黏度实验设备简单,操作便利,有相当好的精确度,是表征聚合物相对分子质量的有效手段之一[1]。一定质量浓度的多糖溶液,其黏度直接反应相对分子质量。在其他因素固定不变的情况下,多糖相对分子质量越高,其溶液的黏度就越大；反之则越小[2]。本文利用Mark-Houwink经验公式[η]=KMα计算多糖分子的平均相对分子质量。作为一种测试高聚物分子质量的重要手段,黏度法测定高聚物分子质量在工业生产及科学研究中的应用也较广泛[3-4]。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

麦冬,市售,浙江慈溪产；葡萄糖,天津市科密欧化学试剂开发中心；右旋糖苷(葡聚糖),Sigma公司；麦冬多糖,实验室自制；麦冬多糖酶水解产物,实验室自制。数字式黏度计 DV-1,上海尼润。

1.2 实验方法

1.2.1 麦冬多糖的提取

本实验室采用水提醇沉法提取麦冬多糖。先将麦冬块根在60 ℃烘干,粉碎成粗粉,取一定量的麦冬粉末,加入10倍体积量的水,煎煮3次,每次0.5 h,过滤,并合并滤液,70 ℃减压浓缩至1∶1,再加入乙醇至体积分数为80%,静置析出沉淀,真空干燥并得到黄褐色或淡黄色的麦冬多糖粉末。

1.2.2 黏度法测定麦冬多糖和麦冬多糖酶水解产物的相对分子质量

1.2.2.1α值和K值的确定

在一定温度下,高分子溶液的特性黏度[η]与高聚物分子质量之间存在有以下经验式：

[η]=KMα[5]

(1)

对某一高聚物-溶剂体系,公式中K,α是常数；M为黏均分子质量。常见高聚物-溶剂体系的K,α值都可以从有关手册中查到。

1.2.2.2 麦冬多糖和麦冬多糖酶水解产物的相对分子质量的测定

特性黏度[η]的定义为溶液质量浓度无限稀释情况下的增比比浓黏度(ηsp/ρ)或比浓对数相对黏度(lnηr/ρ)。

(2)

式中,ηr=η/η0(η,η0分别为溶液和纯溶剂在同一温度下的黏度)称为相对黏度,当用同一支黏度计来测定黏度时,ηr≈t/t0(t,t0分别为一定体积的稀溶液及纯溶剂用同一黏度计在同一温度下测得的流出时间)；ηsp称为增比黏度,其公式为：

ηsp=(η-η0)/η0=ηr-1

(3)

增比比浓黏度ηsp/ρ和比浓对数相对黏度lnηr/ρ与质量浓度ρ呈线性关系。因此以ηsp/ρ对ρ或lnηr/ρ对ρ作图可得两条直线(见图1)。按式(2)的定义,将ρ外推时,两条直线在ρ=0处,即纵轴上应交于一点[6],通常是在ηsp/ρ对ρ的图上,或lnηr/ρ对ρ的图上来外推,此点的截距即是特性黏度[η],然后根据式(1)即可求出高聚物的相对分子质量。

1.2.2.3 实验步骤

(1)量取溶剂30 mL纯净水,选用0号转子,测定其黏度并定义为η0；

(2)选用纯净水溶解麦冬多糖粉末,配制成5种不同质量浓度的麦冬多糖溶液,分别为ρ1,ρ2,ρ3,ρ4,ρ5；

(3)采用数字式黏度计,在温度为(20±0.02) ℃时测定对应5种溶液的黏度,分别为η1,η2,η3,η4,η5；

(4)从上述的5个黏度值,可分别计算出对应的5组相对黏度ηr；5组增比黏度ηsp,以及5组比浓黏度ηsp/ρ和5组比浓对数黏度lnηr/ρ；

(5)最后,采用外推法以ηsp/ρ或lnηr/ρ对溶液质量浓度ρ作图,当溶液质量浓度ρ无限稀释至0时,得到被测物质的特性黏度[η],将[η]代入式[η]=KMα,便可计算出麦冬多糖的平均相对分子质量。

其他物质平均相对分子质量的测定原理和方法同上。

2 结果与讨论

2.1 α值的确定

α是与溶液、大分子化合物、温度有关的经验常数。查《物化手册》可得6%的右旋糖苷的α值为0.7[7]。由于麦冬多糖的结构与银耳多糖相似,根据文献[7],在温度、溶剂不变的情况下,银耳多糖与右旋糖苷都是单糖中等聚合度的聚合物(即结构相似),因此在测定麦冬多糖的相对分子质量时可以把α近似为0.7。

2.2 K值的确定

以水做溶剂用右旋糖苷(葡聚糖)标定K值结果如表1所示。

表1 右旋糖苷溶液的黏度测定结果

以ηsp/ρ对溶液质量浓度ρ作图,由图1用外推法得到被测物质的特性黏度,[η]=1.479。已知右旋糖苷的相对分子质量M=40 000,由式(1)得,K=8.88×10-4。

2.3 黏度法测定麦冬多糖相对分子质量

根据Huggins公式,以ηsp/ρ对溶液ρ作图,如图2所示。由图2得麦冬多糖的特性黏度[η]=2.118,代入[η]=KMα式得M=66 837.04。

按照“1.2.2.3”的方法，将麦冬多糖配制成5种不同浓度的溶液，采用黏度法并按照实验方法的步骤分别测定溶剂和上述5种不同浓度溶液的黏度，通过计算和外推法得到麦冬多糖的特性黏度[η]，便可求出麦冬多糖的平均相对分子质量，结果如表2所示。

图1 右旋糖苷溶液比浓黏度和质量浓度的关系

表2 麦冬多糖溶液的黏度测定结果

图2 麦冬多糖溶液比浓黏度和质量浓度的关系

2.4 黏度法测定酶水解产物的平均相对分子质量

按照“1.2.2.3”的方法,将酶反应条件确定后的酶水解产物配制成5种不同质量浓度的溶液,采用黏度法并按照实验方法的步骤分别测定溶剂(酶液)和上述5种不同质量浓度溶液的黏度,通过计算和外推法得到酶反应条件确定后的酶水解产物的特性黏度[η],便可求出上述酶水解产物的平均相对分子质量,结果如表3所示。

根据Huggins公式,用上表黏度法算得的比浓黏度ηsp/ρ对质量浓度ρ作图,结果如图3所示。

表3 麦冬多糖酶水解产物溶液的黏度测定结果

图3 麦冬多糖本科水解产物溶液比浓黏度和质量浓度的关系

图3中,趋势线采用外推法将直线外推至与Y轴的交点为0.014 65,即当酶反应条件确定后的酶水解产物溶液无限稀释时的比浓黏度为0.014 65×102,即酶反应条件确定后的酶水解产物溶液的特性黏度[η]=1.465。根据经验方程[η]=KMα,其中α=0.7,K=8.88×10-4,便可算出酶反应条件确定后的酶水解产物的平均相对分子质量M=39 474.5。

3 结 论

通过用黏度法对麦冬多糖及其酶解产物相对分子质量的测定,确定麦冬多糖的相对分子质量为66 836.5,降解后产物的相对分子质量为39 474.5,说明用黏度法测定多糖相对分子质量的方法可行。同时,通过实验得到的麦冬多糖降解产物的相对分子质量,对今后开发应用麦冬多糖降解产物提供了依据。在今后的实验中,还要对麦冬多糖酶解产物进行大量制备,为麦冬多糖的酶解产物的继续研究提供了物质基础。

[1] 李琳,谭桂莲,苏春梅. 粘度法测定聚乙烯醇相对分子质量的实验改进[J]. 皮革化工, 2001, 18(2):53-57.

[2] 唐振兴,石陆娥,易喻. 壳聚糖及其降解物相对分子质量的测定[J]. 化工技术与开发, 2004, 33(6):38-39.

[3] 赵学苑. 胶体与界面化学试验[M]. 北京:北京大学出版社, 1993:225-231.

[4] ALBERTS B, JOHNSON A, LEWIS J, et al. Molecular biology of the cell[M]. 5th ed. New York:Garland Publishing Incorporated, 2008:653-653.

[4] 程镕时. 粘度数据的外推和从一个浓度的溶液粘度计算特性粘数[J]. 高分子通讯, 1960, 4(3):159-163.

[5] 刘丛敏. 测定聚酯切片特性粘度影响因素探讨[J]. 河南化工, 2008, 25(8):47-48.

[6] 赵秋霞,李清源. 银耳多糖相对分子质量的粘度法测定[J]. 佳木斯医学院学报, 1990, 13(2):101.