甘氨酸氮源对大肠杆菌代谢的影响

许 卫 萍, 田 晶

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

微生物代谢组学力求全面地定性和定量细菌细胞内所有的低分子质量(<1 000)的代谢物,该技术可通过考察生物体系受到刺激或扰动(如某一特定的基因变异或环境变化)后,其代谢产物的波动或其随时间的变化规律来研究生物体系的代谢表型改变[1-2],目前已广泛应用于微生物的生理研究[3]。作者首先利用GC-MS分析E.coli的野生型菌株Y 1.1566及其琥珀酸脱氢酶基因缺失突变株ΔsdhAB(S)两株菌在甘氨酸为氮源条件下的代谢指纹,然后通过多变量数据处理,找到在两株菌细胞内浓度差异较大的化合物,继而分析并解释氮源差异对菌株代谢特别是氨基酸代谢的影响。

1 实 验

1.1 菌 株

E.coli的野生型菌株Y 1.1566及其琥珀酸脱氢酶基因缺失突变株ΔsdhAB(S)由中国科学院大连化学物理研究所提供。

1.2 仪器和试剂

仪器:GC-MS QP2010,日本Shimazu公司；超低温冰箱NU-6518E,NUAIRE -86 ℃ Ultralow Freezer；真空冷冻干燥机FREEZONE4.5,美国Labconco公司；Biofuge stratos高速冷冻离心机,德国Kendro公司。

试剂:癸酸,吡啶,有机酸,氨基酸,N,O-双三甲基硅基三氟乙酰胺(BSTFA+1%TMCS)均购于SIGMA公司；甲醇、氯仿、乙腈(HPLC级)购于Tedia。

1.3 培养基及培养条件

1.3.1 培养基

LB培养基:营养肉汤19.8 g/L。

全合成培养基(mg/L):组成见文献[4]。

1.3.2 培养条件

两株菌在LB培养基中活化培养:35 ℃,160 r/min的通气恒温摇床上振荡培养12 h；取活化后的菌液1%,5 mL生理盐水洗菌体2次,转接入全合成培养基中,250 mL三角瓶装液量为100 mL,在35 ℃、160 r/min的通气恒温摇床上振荡培养12 h。每株菌平行培养6次共产生12个样品。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞干重及菌体生长的光密度测定

取5 mL菌液离心所得沉淀,用生理盐水洗净后在60～100 ℃的烘箱中烘干5 h,称重至恒重(g),细胞质量浓度(g/L)为(m×1 000)/V,菌体的生长情况可以用600 nm下的光密度(OD600)来表示。细胞干重按照文献[5]的方法计算。

1.4.2 样品淬灭和提取

淬灭方法选择冷乙腈淬灭法:取3 mL对数生长期[6]的菌液加入到12 mL冷乙腈中,放入-80 ℃冰箱中淬灭15 min,在4 ℃低温下,10 000g离心10 min,弃去上清液。

提取方法选择甲醇/氯仿提取方法,1.5 mL甲醇和0.75 mL去离子水分别加入每个样品中,同时加入100 μL 0.3 mg/mL的内标癸酸。涡旋1 min后,每个样品加1.5 mL氯仿,在4 ℃条件下静置10 min, 然后离心分层,取甲醇/水层1 mL冷冻干燥[7]。

1.4.3 衍生方法

在冻干后的胞内代谢物中加入50 μL吡啶,超声(480 W)10 min溶解后,再加入60 μL BSTFA+1%TMCS,75 ℃水浴45 min。10 000g离心10 min后取上清用于GC-MS分析。BSTFA+1%TMCS衍生试剂是用三甲基硅烷基团(+72)取代—COOH、—NH2、—SH、—SO2H和—OH上的活泼氢,使不挥发的化合物能够在气相色谱上检测出来。

1.4.4 GC-MS分析方法

色谱柱:DB-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样1 μL；分流比10∶1；70 ℃ (5 min)―5 ℃/min―280 ℃ (5 min)；载气体积流量He 1.5 mL/min；MS:进样口280 ℃,离子源200 ℃,传输线280 ℃,离子扫描:40～600m/z;溶剂延迟5 min;检测电压1 400 V。

1.4.5 数据处理

生成峰表:包括峰号、保留时间、峰面积的峰表由工作站自动积分生成,积分斜率100,最小峰面积10 000。用内标癸酸归一化后输入SIMCA-P软件(Umea,瑞典)中进行模式识别分析,首先使用PCA进行表型区分,再使用PLS-DA方法寻找代谢差异,并用VIP(variable importance in the projection)和“S-plot”筛选潜在标记物。

1.4.6 代谢物定性

实验使用NIST库(National Institute of Standards and Technology)作为定性的标准谱库,定性过程由仪器工作站完成。定性信息如相似度、CAS号和化合物名称列于峰表内。相似度大于75的化合物认为定性结果可靠,部分化合物由标样验证。

2 结果与讨论

2.1 两株菌生长曲线比较

图1为采用比浊法测定E.coli的野生型菌株Y1.1566及其琥珀酸脱氢酶基因缺失突变株ΔsdhAB(S)的生长曲线。由图1可知,在氮源限制培养条件下,与野生型菌株Y1.1566相比琥珀酸脱氢酶基因缺失突变株ΔsdhAB(S)具有显著的不同。ΔsdhAB(S)的生物量明显低于Y1.156 6,由此可知,敲除ΔsdhAB(S)对于菌株生长较为不利[5]。

图1 两株菌的生长曲线

2.2 两株菌代谢差异分析

利用有监督模型识别方法PLS-DA对两株菌代谢差异进行分析,并找出在分类中起重要作用的潜在变量。对于PLS-DA模型一般认为R2Y(分类信息解释能力)至少大于0.5,同时R2Y和Q2(预测率)之间差在0.2～0.3。由图2可以看出,R2Y为0.995,Q2为0.967说明模型有很好的预测能力并对分类信息解释能力较强,能很好地将两类样品分开。

图2 Y1.1566和ΔsdhAB在氮源限制培养条件下的PLS-DA模型

2.3 潜在标记物的选择

PLS-DA模型中一般认为VIP大于1的变量均可认为是潜在标记物。在将潜在标记物与生物学信息相关联前,需对潜在标记物进行筛选。PLS-DA模型VIP大于1的共有132个代谢物,大于2的共有30个[图3(a)]。在S-plot上,有14个代谢物位于“S”两端[图3(b)],这意味着它们对分类贡献度和可靠性较高,因此被确定为潜在标记物,最后经过t检验筛选出8个显著性高的化合物(表1)。

结合图3(a)、3(b)及表1可以看出,一些胞内代谢物浓度在两株菌中发生了变化。VIP最大为吡喃葡萄糖苷,其次为葡萄糖醇和甘氨酸。虽然琥珀酸脱氢酶被敲除,但琥珀酸浓度变化对两株菌代谢区分的贡献只占很小一部分(VIP=1.88)。这也间接说明了一个较普遍的现象:从代谢物水平看,遗传改造的靶点往往不是直接受到最大影响之所在。在氮源限制条件下,E.coli野生型与敲除琥珀酸脱氢酶基因型菌株的生长由于遗传的改变,其生长状态及体内代谢都受到影响。而对于敲除琥珀酸脱氢酶基因型的S菌,虽然琥珀酸在体内得到积累,但并不是变化最显著的化合物。琥珀酸作为TCA的中间代谢产物,在有氧环境下,不会过多积累,这与文献[8]报道的结果是一致的。

图3 多变量统计分析结果

由于本研究所用培养基为甘氨酸氮源,因此又着重对细胞内氨基酸之间的变化进行了分析。对所鉴定的氨基酸之间相关系数具有显著性(p<0.05)的化合物,构建网络图见图4。从图4中可以看出敲基因(a)和野生型(b)株中,脯氨酸、异亮氨酸与谷氨酰胺之间的关系发生的变化最明显。

3 结 论

氮源限制条件下,E.coli敲基因型菌株由于琥珀酸脱氢酶的敲除,导致细胞内诸多代谢物浓度发生变化,尤其是调节高渗状态生长特性的氨基酸发生变化,生长曲线反映了S株生长受到抑制。本研究也说明单个基因的改变引起的代谢变化是比较广泛的。

图4 细胞内主要氨基酸代谢物相关分析

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