不同pH下对硝基酚(p－NP)对小球藻和斜生栅藻的毒性

冯鸣凤，赵 娜，王 轲，王林同，朱 琳*

1.南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津 300071

2.天津市环境保护科学研究院，天津 300071

不同pH下对硝基酚(p－NP)对小球藻和斜生栅藻的毒性

冯鸣凤1，2，赵 娜1，王 轲1，王林同1，朱 琳1*

1.南开大学环境科学与工程学院，环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津 300071

2.天津市环境保护科学研究院，天津 300071

为研究水体中典型有机污染物的环境基准，考虑环境因子对污染物生物效应的影响，选取生长速率(μ)，无可观察效应浓度(NOEC)，最低可观察效应浓度(LOEC)和半抑制浓度(EC50)为指标，研究了不同pH(7，8和9)对小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)的生长以及对对硝基酚(p-NP)毒性的影响.结果表明:pH为7～9时，小球藻和斜生栅藻均可正常生长，但各自最适生长的pH不同，小球藻的最适生长pH为8，而斜生栅藻的最适生长pH为9.p-NP对小球藻和斜生栅藻的毒性均随pH的增大而降低，pH为9时毒性最小，但p-NP对斜生栅藻的毒性比对小球藻的大，即斜生栅藻对p-NP要比小球藻更敏感.因此，在研究p-NP的水生态基准时，应该考虑pH的影响.

生态基准;对硝基酚;pH;小球藻;斜生栅藻

Abstract:In order to study the environmental criteria of typical organic contaminants in aquatic systems，the influence of environmental factors on their biological effects was considered.End points of growth rate(μ)，NOEC，LOECandEC50were selected as evaluation indices to study the growth ofChlorella vulgarisandScenedesmus obliquus，and thep-nitrophenol(p-NP) toxicity to them at pH levels 7，8 and 9.The results showed that bothChlorella vulgarisandScenedesmus obliquuscould grow well at the range of pH 7-9，but the most suitable pH condition was different for each of them.Chlorella vulgarisgrew best at pH 8，whileScenedesmus obliquusgrew best at pH 9.The toxicity ofp-NP toChlorella vulgarisandScenedesmus obliquusdecreased with increasing pH，and the least toxic effectwas observed at pH 9.Thep-NP was more toxic toScenedesmus obliquusthanChlorella vulgaris，that is，Scenedesmus obliquuswas more sensitive to the toxicity ofp-NP thanChlorella vulgaris.Therefore，the influence of pH should be considered when an aquatic ecological criteria ofp-NP are selected.

Keywords:ecological criteria;p-nitrophenol;pH;Chlorella vulgaris;Scenedesmus obliquus

环境基准是制定环境标准的科学基础，决定着环境标准的科学性、准确性和可靠性.为了进一步完善和发展我国现有水环境质量标准体系，迫切需求开展系统、全面、科学的水环境质量基准研究.

水质基准的制订是以污染物对水生生物和人体健康的毒理学研究为基础的［1］.水生态系统的环境因子，如pH，光照，温度，盐度，浊度和营养物质等多种因素都会影响污染物在水环境中的物理、化学和生物过程，从而导致不同的生态效应，影响污染物水环境质量基准的制订.环境因子与污染物之间对藻类毒性存在着交互作用，FRANKLIN等［2］的研究表明，不同pH条件下，铜和铀对小球藻(Chlorellasp.)毒性不同;FAHL等［3］研究了灭草剂磺酰脲对绿藻(Chlorella fusca)的毒性与pH的关系.虽然在早期国外的研究中，已经注意到了环境因素对污染物毒性的影响，但由于环境因子和生物种类等因素的地域特性，使水质基准也具有了地域特性.因此，在进行相关研究时，不能直接照搬现有的结果，应该根据水生态类型的特点，从基础性的工作做起.

对硝基酚(p-NP)水溶性高，易进入水体，其主要通过染料生产、皮革加工、农药生产、空气中硝基苯的光化学氧化、汽车尾气排放和有机磷酸酯类农药的降解等途径进入环境中，美国部分水体中已达到了10-6，其在水体中的大量存在对水生生物造成了影响［4-5］.我国辽河流域ρ(p-NP)达到了8.929μg/L，底泥中的w(p-NP)达到了733.133μg/kg，并且在太湖流域水体中也已检出p-NP［6］.p-NP是许多国家环境优先监测的污染物之一，也是我国提出的环境优先监测的6种酚类之一［7］.因此，有必要开展p-NP的生态基准研究.

笔者选择太湖、辽河的优势种小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生栅藻 (Scenedesmus obliquus)为试验生物，研究不同pH(为7，8和9)下p-NP毒性效应的变化，以期为水生态基准方法学研究提供依据.

1 材料与方法

1.1 试验材料

普通小球藻(Chlorella vulgaris)和斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)均购自中国科学院水生生物研究所，经实验室驯化培养后，选取处于对数生长期的藻种进行试验.

人工气候箱(SPX-400IC，上海博迅实业有限公司医疗设备厂);紫外可见分光光度计(UV755B，上海精密科学仪器有限公司);pH测定仪(ORP-431，上海大普仪器有限公司);无菌工作台(JHK-A，天津市中环试验电炉有限公司);高压灭菌锅(HVE-50，日本HIRAYAMA公司);生物显微镜(HFX-Ц，日本Nikon公司)和血球计数板(上海市求精生化试剂仪器有限公司).

NaNO3，K2HPO4，MgSO4，CaCl2· 2H2O，Na2EDTA，Na2CO3，H3BO3，MnCl2·4H2O，ZnSO4· 7H2O，Na2MoO4·H2O，CuSO4·5H2O，Co(NO3)2· 6H2O，柠檬酸(C6H8O7)，柠檬酸铁(FeC6H5O7· 5H2O)和对硝基酚(p-C6H5NO3)均为分析纯，购自天津市北方天医化学试剂厂.

1.2 试验方法

1.2.1 藻种的活化、培养与生长抑制试验

试验参照OECD［8］标准方法，以 BG11［9］为培养基，8层无菌纱布封口，置于人工气候箱中进行培养.温度为(25±2)℃，光强为3 000～4 000 lx，光暗比为12 h∶12 h，静置培养，每天定时摇动3次，预培养3代.正式试验采用国际通用的“瓶法”，250 m L锥形瓶中接100 m L处于对数生长期的藻液(藻细胞密度为2×105mL-1).用表1所示通过预试验确定的p-NP系列浓度配制培养液，每个浓度组设3个平行，然后根据太湖和辽河水体的实际pH范围(7.25～9.00)［10-11］，选择7，8和9为试验pH，用0.1 mol/L的NaOH和HCl调节pH分别为(7.0±0.2)，(8.0±0.2)和(9.0±0.2).

表1 试验采用的ρ(p－NP)Table 1 The mass concentrationp-NP in test

1.2.2 细胞密度测定与相对抑制率计算

采用血球计数板测定藻细胞密度，并同时于680 nm处测定其光密度，建立光密度与藻细胞密度的关系曲线，用以表征生物量.小球藻和斜生栅藻的光密度-藻细胞密度关系曲线分别为:

式中，x为光密度;y为藻细胞密度，104m L-1.

测定培养 96 h后藻液光密度，并根据OECD［8］计算对照组和测试组比生长率(μC和μT)及二者比值(μT/μC).

1.3 数据处理

采用SPSS 13.0的方差分析和LSD检验进行差异显著性分析和多重比较(P≤0.05差异显著)，求出无可观察效应浓度(NOEC)和最低可观察效应浓度(LOEC);进行Probit分析，得到96 h半抑制浓度(EC50)及其95%置信区间(95%C. L.);绘图采用Origin 8.0软件.

2 结果与分析

2.1 不同pH下小球藻和斜生栅藻的生长状况

图1为不同pH下小球藻和斜生栅藻空白组的96 h比生长率.如图1所示，同一pH下，斜生栅藻的生长速率明显高于小球藻.但2种藻在不同pH下的生长速率均不同.

图1 不同pH下小球藻和斜生栅藻的比生长率Fig.1 Specific growth rate ofChlorella vulgarisandScenedesmus obliquusat different pH

小球藻在pH为7，8和9时的比生长率分别为0.48，0.52和 0.46，经一维方差分析，pH为 8时的比生长率明显高于其他pH(P＜0.05)，而在pH为7和9时的差异不显著(P＞0.05).斜生栅藻在pH为7，8和9时的比生长率分别为0.65，0.67和0.69，其中pH为9时的比生长率显著高于pH为7(P＜0.05)，但pH在7～8和8～9的差异均不显著(p＞0.05).综上，小球藻最适生长pH为8，斜生栅藻为9.

2.2 不同pH下p-NP对小球藻的毒性影响

图2为不同 pH下小球藻比生长率比值与p-NP的浓度-效应关系.如图2所示，在3个pH下，小球藻的比生长率比值都随着ρ(p-NP)的增加而降低，但不同pH下ρ(p-NP)对小球藻的毒性又存在差异.

图2 不同pH下小球藻96 h比生长率比值与ρ(p－NP)的关系Fig.2 Dose-effect relationship between specific grow th rate ofChlorella vulgarisand natural log ofp-NPmass concentration at different pH

通过 SPSS 13.0软件进行多因素方差分析(ANOVA).结果表明，pH在7～8差异不显著(P＞0.05)，其EC50分别为27.19和27.62 mg/L (见表2).但当ρ(p-NP)较低(≤18.00 mg/L)时，小球藻在pH为8时较敏感，其LOEC为1.80 mg/L.pH为 9时p-NP的毒性明显降低，其LOEC和EC50分别为 42.0和 47.71 mg/L，经ANOVA分析表明，其毒性显著低于pH为7和8 (P＜0.05).

2.3 不同pH下p-NP对斜生栅藻的毒性影响

图3为不同pH下斜生栅藻比生长率比值与p-NP的浓度关系.如图3所示，3个pH下，斜生栅藻的比生长率都随着ρ(p-NP)的增大而显著降低，但不同pH间ρ(p-NP)对斜生栅藻的毒性又有差异.

通过 SPSS13.0软件进行多因素方差分析(ANOVA)，结果表明，3个pH下的p-NP的毒性差异显著(p＜0.05)，但均随着pH的升高而降低. pH为7，8和9时，对应的EC50分别为6.89，10.84和22.56 mg/L(见表3).pH为7时斜生栅藻最敏感，其LOEC为1.0 mg/L，而pH为9时毒性最小.

表2 不同pH下小球藻的96 h NOEC，LOEC和EC50(95%C.L.)

Table 2 96 hNOEC，LOECandEC50(95%C.L.)ofChlorella vulgarisat different pH

测试终点ρ(p-NP)/(mg/L) pH=7 pH=8 pH=9 NOEC/(mg/L)1.80 0.56 32.00 LOEC/(mg/L) 5.60 1.80 42.00 EC50(95%C.L.)/(mg/L) 27.19(25.58～28.78) 27.62(23.96～31.32) 47.71(43.36～53.37)

表3 不同pH下斜生栅藻的96 h NOEC，LOEC和EC50(95%C.L.)Table 3 96 hNOEC，LOECandEC50(95%C.L.)Scenedesmus obliquusof at different pH

图3 不同pH下斜生栅藻96 h比生长率比值与p－NP的浓度－效应关系Fig.3 Dose-effect relationship between specific growth rate ofScenedesmus obliquusand natural log ofp-NP concentration at different pH

3 讨论

国内外对酚类的生态毒理学研究已经将近25年，并且已对pH与酚类毒性的关系及机理进行了研究［12-15］.HOWE等［16］研究了不同 pH下硝基酚类对 虹 鳟 鱼 (Oncorhynchus mykiss)和 糠 虾(Gammarus pseudoltmnaeus)的毒性，结果表明，在12℃，pH为6.5和9.5时，p-NP对虹鳟鱼的96 hLC50分别为3.80和78.90 mg/L，对糠虾96 hLC50分别为 2.80和 42.50 mg/L;2，4-二硝基酚(2，4-DNP)在上述条件下，对虹鳟鱼的96 hLC50分别为0.39和27.10 mg/L，对糠虾96 hLC50分别为0.60和25.60 mg/L.pH为9.5时的毒性显著低于pH为6.5时的毒性.CRONIN等［14］通过对包括邻硝基酚(o-NP)和间硝基酚(m-NP)在内的11种酚类在不同 pH下对大型溞(Daphnia magna)的毒性进行了研究，结果表明，其EC50随pH增大而增大.NALEZCZ等［17］研究了NPs对发光菌(Vibrio fischeri)在不同 pH下的毒性，根据其15 minEC50结果显示，试验选用的几种 NPs的毒性均随pH的增大而减小.于瑞莲等［18］的研究也得到了相一致的结果.这些与笔者所研究的不同pH下ρ(p-NP)对小球藻和斜生栅藻的毒性结果基本一致.

pH会改变弱酸性或弱碱性有机物的解离度和辛醇-水分配系数(KOW)等性质.硝基酚为弱酸性有机物，当 pH增大时，其离子化程度升高.分子态更易穿过细胞膜而进入胞内，因而毒性更大，该理论已得到普遍认可［19-21］.也有学者认为，由于pH升高改变了酚类的lgKOW，从而使其脂溶性降低，对其生物浓缩或累积产生影响，并且 pH对酚类毒性的影响主要是由于 pH会影响酚类生物累积性所致［15-16，22-24］.FISHER 等［22］的研究证实了上述论断，在10℃，pH为6.5，7.5和8.5时，五氯酚(PCP)对斑马贝(Dreissena polymorpha)的生物浓缩系数(BCF)分别为1 194，613和429. NEWSTED等［23］的研究表明，不同 pH时，苯酚在羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)体内的生物浓缩系数(BCF)不同，并且当pH在4.0～10.0变化时，BCF先增大后减小.HOWE等［16］的研究还表明，p-NP和2，4-DNP对虹鳟鱼和糠虾的BCF均随pH增大而减小.KISHINO等［15］研究了不同pH条件下PCP对金鱼的毒性和体内累积性之间的关系，结果表明，pH为5.5～10.0时，PCP的毒性和生物累积性都降低，并且其5 hLC50与暴露在0.1 mg/L PCP下的5 h lgBCF之间有很好的相关性.

从该研究的结果看，虽然在试验的 pH范围内，小球藻和斜生栅藻都可以正常生长，但其生长最适的pH不同，小球藻为8，而斜生栅藻为9，这与已有的研究结果一致［25-26］.大量研究［25-30］表明，每种藻都有各自最适生长的 pH范围，这主要是由于不同藻类自身的生理差异造成的.这种差异还影响了不同藻对污染物的敏感性和耐受性，该研究中小球藻和斜生栅藻对p-NP的敏感性(LOEC)和耐受性(EC50)不同.斜生栅藻比小球藻敏感，小球藻在 pH为8时敏感性最好，斜生栅藻在pH为7时最敏感.而小球藻的耐受性强，其EC50为斜生栅藻的2～4倍，但二者均在 pH为9时耐受性最大.陈传平等［31］研究苯胺和苯酚对淡水藻类生长的影响时发现，同一毒物浓度下，斜生栅藻比蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)表现得更为敏感.SABATER等［32］的研究表明，氯黄隆对栅藻和小球藻96 h的EC50分别为0.22和54.0 mg/L，即栅藻更敏感.

污染物对生物的毒性是环境因子、污染物和受试生物三者之间共同作用的结果.该研究的结果表明，小球藻最适生长pH为8，并且此时对p-NP最敏感;而斜生栅藻最适生长pH为9，却在pH为7时最敏感;但这2种藻对p-NP的耐受性都随着pH的增大而增大.也研究了相同试验条件下，Cr6+对小球藻和斜生栅藻的毒性，结果表明，小球藻和斜生栅藻均在其最适生长pH时，对Cr6+的耐受性最强(另文讨论).不同pH下藻的生长状况对Cr6+的毒性有显著影响，而生长状况对p-NP毒性的影响不明显，这表明pH对p-NP存在形态的作用是造成其对p-NP毒性影响的主要因素.

研究表明，p-NP的毒性效应确实受pH的影响.因此，在进行p-NP生态基准相关研究时，pH是一个重要的影响因素，甚至要考虑在区域环境可能的pH范围内，根据不同的pH制订不同的基准和标准值.除 pH外，光照、温度和盐度等环境因子也都有可能会影响p-NP的毒性，因此，进行生态基准研究时，应该首先筛选出对污染物毒性产生影响的重要环境因子.该试验仅从藻类种群水平研究了pH对p-NP毒性的影响，还需要进一步从群落水平以至生态系统水平进行研究.

4 结论

a.藻种不同所适应的生长环境条件也不同，在该试验条件下，小球藻的最适 pH为8，而斜生栅藻的最适pH是9.

b.pH在7～9下，p-NP对斜生栅藻和小球藻的毒性效应均随pH而变化，pH为9时毒性最小.p-NP对斜生栅藻的毒性比对小球藻大，即斜生栅藻对p-NP比小球藻更敏感.

c.pH影响p-NP毒性变化的主要原因可能是其对p-NP化学形态的作用.

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Toxicity of p-NP on Chlorella vulgaris and Scenedesm us obliquus at different pH leve ls

FENG Ming-feng1，2，ZHAO Na1，WANG Ke1，WANG Lin-tong1，ZHU Lin1

1.Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria，Ministry of Education，College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Tianjin 300071，China
2.Tianjin Academy of Environmental Sciences，Tianjin 300071，China

X171.5

A

1001-6929(2011)02-0210-06

2010-05-07

2010-10-29

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX08526-003)

冯 鸣 凤 (1984 -)， 女， 河 北 邢 台 人，m ff840621@163.com.

*责任作者，朱琳(1957-)，男，山东济南人，教授，博士，博导，主要从事生态毒理学研究，zhulin@nankai.edu.cn