万寿菊杀菌素Ⅰ抑菌作用及对西瓜幼苗的影响

范志宏，郭春绒，王金胜

（1.山西农业大学文理学院，山西太谷030801；2.山西农业大学生命科学院，山西太谷030801）

西瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum f sp niveum，FON）引起的毁灭性土传病害，其在我国各西瓜产区都有发生，已成为影响西瓜生产最严重的病害之一[1-2]。目前,防治该病主要采用嫁接、化学农药熏蒸土壤、化学杀菌剂喷灌等，嫁接是最有效的方法，但生产成本较高。使用化学药剂防治，对环境污染大，对牲畜有毒[3]。因此，研究和开发对西瓜枯萎病有效的新型杀菌剂具有重要的意义。而由于菊科植物万寿菊（Tagetes patula）花、叶及根中含有具有特殊活性的化合物而受到特别的重视。国外有关于万寿菊的化学成分和昆虫活性[4]的报道。但是，对万寿菊杀菌、抑菌活性方面的研究较少[3-5]。

本试验采用菌碟法和田间试验方法研究万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病病原菌的抑菌活性以及作用机理，以期为开发防治西瓜枯萎病的植物源新农药提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试西瓜品种 兰州P2，感病品种。

1.1.2 供试菌株 西瓜枯萎病菌，辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum），辣椒疫霉病菌（Phytophthpra capsici Len），均由山西农业大学植物病理学系提供。将菌种接种到培养皿内，25℃无光倒置，进行纯化培养。

1.1.3 万寿菊杀菌素Ⅰ 其为山西农业大学万寿菊杀菌素研究课题组合成。

1.1.4 西瓜枯萎病病原菌毒素粗提液 用理查德液体培养基，在25℃，100 r/min振荡，3 000 lx光照条件下培养西瓜枯萎病菌，20 d后离心滤液（5 000 r/min，15 min），收集上清液即为西瓜枯萎病菌的毒素粗提液。镰刀菌酸的定量以Sigma公司的镰刀菌酸为标准，用标准加入法进行定量[5]。

1.2 方法

1.2.1 抑菌试验 采用菌碟法：用打孔器从事先培养纯化好的菌种中采菌，接种到含0.001，0.010，0.100，1.000 μg/mL万寿菊杀菌素Ⅰ的PDA培养基上，并作空白对照（无药剂的培养基），25℃恒温培养，36，48 h后记录菌丝生长直径。重复3次，计算相对抑制率。

1.2.2 田间试验 挑选饱满的西瓜种子，分别用A溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液（镰刀菌酸含量为4.005 5 μg/mL）和10 μg/mL万寿菊杀菌素Ⅰ的混合液）、B溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和5 μg/mL万寿菊杀菌素Ⅰ的混合液）、C溶液（含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液）、CK（无菌水）浸种6 h，然后用无菌水冲洗干净后用湿纱布包好种子，放1～2倍种子量的无菌沙子，在25℃左右黑暗催芽。当CK有50%～60%种子露白后播种于田间（气温25℃左右）。每处理重复3次。在第1片真叶完全展开时（苗期）作如下处理：处理A，A溶液浸种的西瓜苗再用含80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和10 μg/mL万寿菊杀菌素Ⅰ的混合液灌根；处理B，B溶液浸种的西瓜苗再用80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液和5 μg/mL万寿菊杀菌素Ⅰ的混合液灌根；处理C，C溶液浸种的西瓜苗再用80%西瓜枯萎病菌毒素粗提液灌根；CK，无菌水浸种的西瓜苗再用无菌水灌根。每种处理使用相同药剂液量（约10 mL/株），每处理2株，重复3次。

1.2.3 生理生化指标测定 对苗期的植株168 h内分别测定如下指标：（1）CAT活性，采用Ti4+络合法[5]测定；（2）SOD活性，采用 NBT光还原法[6]测定；（3）POD活性，采用愈创木酚法[6]测定。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度万寿菊杀菌素Ⅰ对不同致病菌菌丝生长的影响

2.1.1 万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌菌丝生长的影响 万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌有明显抑制作用（表1），在质量浓度为0.010 μg/mL时，抑制效果不明显，在达到0.100 μg/mL后，抑制效果显著。与36 h的抑制率相比，48 h低质量浓度的抑制率变化不大，而高质量浓度的抑制率显著下降。说明随着质量浓度的增高，万寿菊杀菌素Ⅰ的抑菌作用增强；而随着时间的延长，抑制作用降低。说明万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌的抑制既有时间效应又有质量浓度效应。

表1 不同质量浓度万寿菊杀菌素Ⅰ对西瓜枯萎病菌的抑制率 %

2.1.2 万寿菊杀菌素Ⅰ对辣椒疫霉病菌菌丝生长的影响 随着药剂质量浓度的增大，万寿菊杀菌素Ⅰ对辣椒疫霉病菌的抑制作用呈增大趋势（表2），说明万寿菊杀菌素I对于辣椒疫霉病菌有质量浓度效应。但是随着时间的推移，抑制作用降低，说明万寿菊杀菌素Ⅰ对辣椒疫霉病菌的抑制作用具有时间效应和质量浓度效应。

表2 不同质量浓度万寿菊杀菌素Ⅰ对辣椒疫霉病菌的抑制率 %

2.1.3 万寿菊杀菌素Ⅰ对辣椒枯萎病菌菌丝生长的影响 对于辣椒枯萎病菌，万寿菊杀菌素Ⅰ的抑制作用在质量浓度最大时比较明显（表3），在相对较低质量浓度的药剂处理下抑制作用变化不明显。在药剂质量浓度达到0.100 μg/mL以后，对辣椒枯萎病菌的抑制作用明显。随着时间的推移，其抑制作用变化不明显，说明在本试验范围内万寿菊杀菌素Ⅰ对于辣椒枯萎病菌的抑制作用有阈值效应。

2.2 万寿菊杀菌素Ⅰ及毒素处理对西瓜幼苗的CAT，POD和SOD活性的影响

2.2.1 处理对CAT活性的影响 西瓜苗期过氧化氢酶（CAT）活性波动幅度较大（图1）。图1结果说明，在西瓜苗期，植物本身生长势弱，自身抗性差，因而在毒素作用下，西瓜的CAT活性降低。当有万寿菊杀菌素Ⅰ存在时（处理A、处理B），其CAT的活性提高，说明万寿菊杀菌素Ⅰ可起到消除枯萎病菌毒素对西瓜的毒害作用，而且该作用随万寿菊杀菌素Ⅰ浓度增大而增大。

表3 不同质量浓度万寿菊杀菌素Ⅰ对辣椒枯萎病菌的抑制率 %

2.2.2 处理对POD活性的影响 在西瓜苗期POD酶明显受到影响（图2）。图2结果说明，随着西瓜的自然生长，POD活性趋于稳定。经过万寿菊杀菌素Ⅰ加毒素处理的植株（处理A、处理B），POD活性始终高于对照，说明万寿菊杀菌素Ⅰ可较长时间作用于植株，提高植株的抗病性。

2.2.3 处理对SOD活性的影响 当用毒素处理时（处理C），西瓜SOD活性下降；万寿菊杀菌素Ⅰ加毒素的处理中（处理A、处理B），SOD活性高于对照，恢复到正常水平（图3），说明万寿菊杀菌素Ⅰ能提高SOD活性。

3 结论与讨论

本研究结果表明，万寿菊杀菌素Ⅰ有较好的抑菌效果。通过在西瓜枯萎病的主要发病期苗期施用万寿菊杀菌素Ⅰ，植株体内生理生化指标有较大变化，表明万寿菊杀菌素Ⅰ能有效减轻西瓜枯萎病菌对植株的毒害作用。

万寿菊杀菌素Ⅰ不但可以抑制西瓜枯萎病菌，还可以促进植株生长。这可能与万寿菊杀菌素Ⅰ一方面诱导了幼苗的抗性，另一方面与万寿菊杀菌素Ⅰ对毒素有一定的钝化作用有关。前人研究表明[7]，CAT，SOD和POD这3个酶与植物抗病有关。SOD，POD可减轻毒素对根系膜系统的破坏，减轻质膜伤害的程度；POD能清除逆境下植株体内产生的有害自由基；SOD专一清除O2-，并抑制毒性更强的·OH生成[8]；CAT可分解体内的过氧化物，是细胞内抗脂质过氧化作用保护系统的主要成分之一[9]。本试验中，万寿菊杀菌素Ⅰ的施用提高了SOD，POD的活性，并可维持CAT活性，因此，万寿菊杀菌素Ⅰ的施用能提高西瓜植株内保护酶活性，降低膜脂过氧化作用，保护生物膜，有效地抑制了西瓜枯萎病菌的为害。

深入研究植物源抑菌剂的作用机理并设计完全新型化学结构的先导化合物，是当前寻找新型、高效抑菌剂的主要途径。万寿菊根提取物中抑菌活性主成分的人工合成及其抑菌作用机理需要作进一步的研究探讨。

本研究为新农药的开发和先导化合物的发现提供了试验依据，同时也为开发新的防治西瓜枯萎病的植物源农药提供了一定的理论基础。

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［6］王金胜.农业生物化学研究技术 [M].北京：中国农业出版社，2001：140-172.

［7］武予清，韩松，李素娟，等.棉籽饼提取液对植物病原菌的抑制作用及其成分分析[J].华北农学报，2006，21（4）：103-105.

［8］王美琴，陈俊美，李新凤.不同碳、氮源对番茄两种内生真菌菌丝生长的影响研究 [J].山西农业科学，2008，36（11）：75-77.

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