仙灵脾对大鼠卵巢中雌孕激素受体和Fas、Bcl－2 的影响

金富锐，陈慧铮

(1.上海国际和平妇幼保健院，上海 200025;2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

下丘脑－垂体功能失调引起的继发性闭经是临床常见的一种闭经，其治疗方式多采用雌、孕激素周期治疗，但部分患者于停药后仍呈现月经异常。有研究认为，此时，采用中西药联合治疗可提高治疗效果［1］，减少停药后的再次闭经。本研究采用诺雷德建立中枢性闭经动物模型，用中药仙灵脾进行治疗，为本类疾病治疗提供一种有效的治疗方法。

1 资料与方法

1.1 实验动物及给药方法

性成熟而未生育、体质量200g的雌性Wistar大鼠共40只，随机分为4组:对照组、诺雷德组、仙灵脾组、雌激素组，每组各10只。

对照组:注射生理盐水0.2ml;诺雷德组:注射诺雷德，0.2ml/只;仙灵脾组:注射诺雷德 0.2ml后，给予仙灵脾(0.2g/天)灌胃28天;雌激素组:注射诺雷德0.2ml后，给予苯甲酸雌二醇(0.072g/d)肌注28天。

第28天处死大鼠，取出卵巢组织，放入4%的多聚甲醛中，梯度酒精脱水后石蜡包埋，放入4℃冰箱待测。冰冻切片与杂交前预处理，杂交及杂交信号检测参照试剂盒操作。

1.2 药物及试剂

诺雷德(英国阿斯利康制药公司);仙灵脾(天江中药);苯甲酸雌二醇(上海信谊制药);原位杂交试剂盒(北京源德生物医学工程有限公司)。

1.3 统计方法

实验数据采用F检验。

2 实验结果

测定指标为阳性目标面密度，各组结果如下。

2.1 雌、孕激素受体水平的变化 见表1。

表1 雌、孕激素受体水平的变化(±s)

表1 雌、孕激素受体水平的变化(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与诺雷得组比较，△P ＜0.05。

卵巢雌激素受体 卵巢孕激素受体对照组0.166 ±0.036 0.211 ±0.009诺雷德组 0.108 ±0.012* 0.130 ±0.015*雌激素组 0.159±0.032△ 0.145±0.038仙灵脾组 0.162±0.052△ 0.198±0.021△

如表1所示，诺雷德组卵巢雌、孕激素受体水平较对照组均有下降(P＜0.05);雌激素组和仙灵脾组卵巢雌激素受体均较诺雷德组有显著增高(P＜0.05);仙灵脾组卵巢组织孕激素受体较诺雷德组有显著增加(P＜0.05)，雌激素组卵巢孕激素受体较诺雷德组有增高趋势，但没有统计学意义。

2.2 Fas和Bcl－2表达变化 见表2。

表2 Fas和Bcl－2表达变化(±s)

表2 Fas和Bcl－2表达变化(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05;与诺雷得组比较，△P ＜0.05。

Fas Bcl－2对照组0.022 ±0.006 0.171 ±0.025诺雷德组 0.033 ±0.002 0.105 ±0.010*雌激素组 0.028 ±0.010 0.129 ±0.033仙灵脾组 0.025±0.009△ 0.153±0.026△

如表2所示，诺雷德组中Fas表达显著高于对照组;仙灵脾组Fas表达较诺雷德组有显著降低(P＜0.05)，雌激素组则没有显著变化。诺雷德组Bcl－2表达显著低于对照组，仙灵脾组处理后则显著高于诺雷德组(P＜0.05)，而雌激素组无明显变化。

3 讨论

3.1 动物模型的成功建立

诺雷德是一种注射用的促黄体生成素释放激素类似物，通过负反馈作用下丘脑，抑制下丘脑产生促性腺激素释放激素;同时还能竞争性地与垂体细胞膜上的促性腺激素释放激素受体或促黄体激素释放激素受体结合，阻止垂体产生卵泡刺激素和黄体生成素，从而减少卵巢分泌雌激素。采用诺雷德建立的动物模型成功模拟了下丘脑性－垂体性闭经，经处理后的大鼠失去原有的动情周期。动物解剖时可见子宫卵巢的形态均发生了萎缩现象。诺雷德动物模型的卵巢组织中的雌、孕激素受体均有显著下降，由于激素受体的含量受垂体激素LH(黄体生成素)和FSH(卵泡刺激素)的调整，可以推测诺雷德对大鼠下丘脑－垂体功能产生抑制作用。

3.2 仙灵脾对大鼠卵巢组织中雌、孕激素受体的影响

动物模型建立成功后，分别采用苯甲酸雌二醇和仙灵脾进行治疗，治疗结束后检测卵巢组织中雌、孕激素受体的含量变化。结果发现，在卵巢组织中，雌激素组的雌激素受体比诺雷德组有显著增高，但孕激素受体无明显变化，仙灵脾组的雌激素受体和孕激素受体较诺雷德组有显著升高，两组的雌激素受体无显著差异。该研究结果表明，仙灵脾和雌激素都可以修复卵巢雌激素受体，但只有仙灵脾具有修复卵巢孕激素受体的效果，因此，仙灵脾的修复作用更具优势。既往的研究结果发现［2］，仙灵脾对米非司酮处理过大鼠卵巢组织的雌孕激素受体同样具有修复作用，但尚无研究探讨其对诺雷德处理过的大鼠卵巢组织是否有修复作用。

3.3 仙灵脾对大鼠卵巢组织Fas和Bcl－2表达的影响

细胞凋亡促进基因Fas和细胞凋亡抑制基因Bcl－2都存在于卵巢组织中，对卵泡发育发挥重要作用［3］，诺雷德组大鼠卵巢组织中Fas水平显著升高，Bcl－2则明显降低，说明诺雷德通过促进细胞凋亡对大鼠卵巢功能产生抑制作用，而通过雌激素治疗后的大鼠卵巢组织中细胞凋亡因子水平没有明显增加，说明雌激素不能通过修复细胞凋亡过程达到修复卵巢功能的作用，而仙灵脾组的Fas和Bcl－2水平及基本接近正常状态，仙灵脾可以通过修复细胞凋亡过程修复卵巢功能。

3.4 仙灵脾对雌孕激素受体的改善作用

仙灵脾，味甘辛、性温、入肝肾二经，具有补肾、壮阳、祛风除湿之功效，李时珍在《本草纲目》中称其能“益精气，坚筋骨、补腰膝、强心力，乃手足阳明三焦命门药也，真阳不足者益之”。其主要成分为黄酮类成分，实验证明，能促进精液分泌、改善免疫系统功能、改善心血管的流量，且在抗衰老、镇静、催眠、抗疲劳等方面有作用，能增强下丘脑－垂体－卵巢轴及肾上腺皮质轴，胸腺轴等内分泌系统的分泌功能［4］。仙灵脾有温补肾阳之功，使肾气充足，血海充盈，则经自调。

4 结论

本研究结果表明，仙灵脾通过改善卵巢组织中的细胞凋亡过程修复卵巢功能，进而上调卵巢组织中雌、孕激素受体的水平。这为临床实践中，采用雌激素和仙灵脾联合治疗提高疗效提供了理论依据。

5 展望

随着生活节奏的加快及社会的发展，女性工作压力不断增加，大脑皮层处于长期紧张状态，下丘脑功能受到抑制，由此引起月经稀发甚至闭经等亚健康状态。另外，药流人流后引起的稀发月经、闭经日益增多。临床上多采用人工周期治疗，一般治疗周期为3～6个月，停药后的月经失调复发成为治疗该病的难点之一。中医药治疗本病的特点是从整体入手，改善人体的状态，如果说人工周期治疗是治标，那么中西医联合治疗应该是一种标本兼治的好办法。但中药治疗个体差异大，用药方法繁琐，难以标准化，临床依从性较差。因此，本研究致力于采用仙灵脾这一传统中药的单剂型进行治疗，仙灵脾具有性激素样作用，能够明显提高性腺对促性腺激素的反应，药味少，易于坚持，长期应用，未见副作用，有深入研究价值。一方面，可明显改善生殖轴的功能，另一方面，改善机体整体状态，为今后治疗此种疾病提供理论依据。

［1］ 巴文君，孙丽萍，张秋菊，等.补骨脂对初老小鼠体内雌孕激素水平作用实验研究［J］.中医药学报，2010，38(5):19 －21.

［2］ 金富锐.仙车饮对RU486处理后大鼠雌孕激素受体的改善作用［J］.中医药学报，2006，23(2):63 －64.

［3］ 李梅，李志凌，李红发.多囊卵巢综合征卵巢小卵泡上凋亡调控蛋白 Bax、Bcl－2 及 Fas、FasL 的表达［J］.实用医学杂志，2004，20(9):1027－1029.

［4］ 许青媛.淫阳藿对大鼠性腺功能的影响［J］.中药药理与临床，1996，12(2):22 －23.