HPLC法测定紫菀及其蜜炙品中槲皮素及山奈酚含量

曹思思，王伟明，霍金海，任晓蕾

(黑龙江省中医研究院，黑龙江 哈尔滨 150036)

紫菀为菊科植物(Aster tataricus L.f.)的干燥根及根茎。具有润肺下气，化痰止咳的功效，主要用于痰多咳嗽，新久咳嗽，劳嗽咳血［1］。且临床多用紫菀蜜炙品，增强紫菀润肺、祛痰的功效。紫菀的化学成分有萜类及其皂苷、肽类、香豆素、黄酮类、蒽醌类、甾醇及有机酸类等。现代研究表明，从紫菀中分得的肽类成分具有很好的抗肿瘤活性。一般研究认为，紫菀发挥止咳平喘作用主要成分为其中的三萜类成分［2－3］。但近年发现，紫菀的黄酮类成分具有抗氧化、止痛、免疫调节等生物活性［4－7］，如其中的山柰酚、槲皮素具有明显的抗氧化作用，在抑止溶血、脂质过氧化物反应和免疫调节方面均具有显著的作用。紫菀抗肿瘤作用也与其所含的黄酮类及有机酸成分有很大的相关性［8］。2010版《中国药典》未对紫菀黄酮类成分山奈酚、槲皮素的含量进行控制，关于其炮制前后黄酮类成分含量变化亦未见报道。鉴于紫菀新的药用价值，需建立其黄酮类成分的含量测定方法，并阐明其蜜炙前后紫菀中黄酮类成分含量规律，为其临床合理应用提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD检测器);Diamonsil钻石 C18色谱柱 (4.6mm ×250mm，5μm);BP211D型电子天平(德国 Sartorius公司);KQ－300DB型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司);ATC－2－5－U超纯水机(艾科浦公司)。

1.2 试药

槲皮素(批号 09120411)，山奈酚(批号09122421)均由中国药品生物制品检定所提供;甲醇(色谱纯);水为超纯水;其他试剂均为分析纯。

紫菀饮片(安徽沪潐中药饮片厂，批号20071214)。经黑龙江省中医研究院王伟明研究员鉴定为(Aster tataricus L.f.)。

蜜炙紫菀由黑龙江省中医研究院制剂室按2010版《中国药典》制备(每1g蜜炙品相当于0.89g生药材)。

2 方法与结果［9－10］

2.1 色谱条件及系统适用性 色谱柱Diamonsil C18(4.6mm ×250mm，5μm);流动相甲醇 －0.4% 磷酸(50∶50)，流速 1.0ml/min，检测波长 360nm，柱温30℃。在该色谱条件下，样品中的槲皮素、山奈酚与其他峰均能达到基线分离，槲皮素出峰时间在12min左右，山奈酚除峰时间在21min左右，对照品与样品的色谱图见图1。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取槲皮素对照品3.71mg、山奈酚对照品2.53mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成浓度分别为 101.2ug/ml、148.4ug/ml的标准溶液作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取紫菀粉末(过60目筛)1g，加入80%甲醇25ml超声提取 30min，补足重量，微孔滤膜(0.45μm)滤过，滤液取1ml至50ml容量瓶中定容，作为供试品溶液。

2.4 线性关系的考察

精密吸取对照品溶液 2.5、5、10、20、25μL 分别注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下进样，测定峰面积，以峰面积为横坐标，槲皮素、山奈酚量为纵坐标作标准曲线，测得槲皮素的线性回归方程为 y=3 313.1x+5.943 5，r=0.999 9，山奈酚的回归方程为y=3 423.3x+5.265 2，r=0.999 9。结果表明，槲皮素在0.371μg～3.71μg范围内呈良好线性关系，山奈酚在0.253μg～2.53μg范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取槲皮素和山奈酚混合对照品溶液，连续5次进样10μL，测定峰面积，测得槲皮素 RSD为1.67%、山奈酚RSD为1.45%，表明该方法精密度良好。

2.6 重复性实验

分别取同批样品5份，依照样品制备方法，制成供试品溶液并测定其所含槲皮素、山奈酚含量，测得槲皮素RSD值为1.04%，山奈酚RSD值为1.21%，结果表明，本方法的重复性较好。

2.7 稳定性实验

精密称取紫菀粉末约5g，按供试品溶液制备项下平行制备5份样品溶液，每份样品进样10μl，分别测定在 0h、2h、4h、8h、24h 进样 10μL，测定样品中山奈酚、槲皮素的峰面积，计算得槲皮素的 RSD值为1.55%，山奈酚RSD值为0.98%。结果表明，供试品溶液在24h内稳定。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的紫菀粉末约2g，加入一定量的对照品溶液，按供试品溶液制备项下平行制备样品溶液5份，每份进样10μl，测定槲皮素、山奈酚含量，计算加样回收率，结果见表1、表2，测得槲皮素的平均回收率为100.24%、RSD值为1.00%;山奈酚平均回收率为100.68%、RSD值为0.73%，表明该方法测定结果准确。

表1 槲皮素含量测定方法学加样回收试验结果

表2 山奈酚含量测定方法学加样回收试验结果

2.9 样品含量测定

取5批样品，按2.1.3项下平行制备5份样品溶液，每份样品进样10μL供HPLC分析，测定槲皮素、山奈酚的含量。生紫菀槲皮素含量为0.168 0mg/g，蜜炙紫菀槲皮素含量为0.130 8mg/g，折合成生药量后槲皮素含量为 0.146 9mg/g，槲皮素含量降低12.56%;山奈酚含量为0.164 2mg/g，山奈酚含量为0.121 3mg/g，蜜炙紫菀折合成生药量后，山奈酚含量为0.136 3mg/g，含量降低16.99%。

图1 标准品及紫菀样品HPLC色谱图

3 讨论

本实验在提取时对提取溶剂进行了考察，分别以50%、80%、100%甲醇进行提取，当甲醇浓度低时易引入杂质对含量测定结果造成影响;又比较了水浴回流、索氏提取、超声提取的提取效果，发现提取率相近，鉴于超声提取简单易操作，因此选择超声听取方法。综上，最终确定以80%甲醇超声提取30min作为本试验的提取方法。

蜜炙前后紫菀中黄酮类成分槲皮素、山奈酚的含量均有所下降。由于槲皮素、山奈酚与抗氧化、抗肿瘤药理作用紧密相关，因此，在应用紫菀作为抗氧化药物时，应以生用为宜。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京:化学工业出版社，2010:322.

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