响应面法优化蛋白酶提取贻贝蛋白的工艺参数

曹 川，包建强

（上海海洋大学食品学院，上海201306）

贻贝不仅具有很高的食用价值，还富含蛋白质、多聚不饱和脂肪酸、矿物质、维生素等营养物质，具有抗疲劳、抗肿瘤、增强免疫力等保健功能。但是，随着贻贝养殖产量的增加，如何充分高效地利用贻贝资源，开发出更多更好的深加工贻贝产品，既是贻贝产业面临的巨大机遇，也是贻贝产业的一个挑战[1]。因此，对于贻贝深加工利用的研究也受到越来越多科研工作者的重视[2]。

本研究主要探讨不同条件下不同蛋白酶对贻贝蛋白的提取性能，旨在找出一条适合于工业化生产的贻贝蛋白的提取工艺参数，同时也可为用酶法提取其他贝类及水产品蛋白提供借鉴[3]。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 原料 新鲜贻贝，产自嵊泗贻贝养殖基地。

1.1.2 试剂 木瓜蛋白酶，上海博奥生物科技有限公司产品；风味蛋白酶，上海源叶生物科技有限公司产品；中性蛋白酶、胃蛋白酶、福林试剂、三氯乙酸、甲醛等均为分析纯，购于国药试剂有限公司。

1.1.3 仪器设备 氨基酸全自动分析仪L-8800，日立公司产品；凯氏定氮仪Kjeltel2300，丹麦FOSS仪器有限公司产品；全自动粗脂肪测定仪SZF06，浙江托普仪器有限公司产品；酸度计METTLER TOLEDO FIVEEASY和分光光度计UV-1SOOPC SPECTROPHPTO METER，梅特勒托利多仪器有限公司产品；DK-S24电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司产品；冰箱SHARPBCD-171D，夏普公司产品；CS101-2A电热鼓风干燥箱，重庆银河试验仪器有限公司产品；低速离心机，国华电器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 贻贝蛋白提取产物的制备 贻贝肉→配成溶液→调pH值→蛋白酶酶解→灭酶（95℃，10min）→离心（9 000 r/min，20min）→上清液→贻贝蛋白提取产物。

1.2.2 常规成分的测定 总蛋白质含量测定采用凯氏定氮法[4]；氨基态氮含量测定采用甲醛滴定法（GB 5511—85）[5]；脂肪含量的测定采用索氏抽提法（GB 5497—85）[6]；水分含量测定采用105 ℃恒质量法（GB 5512—85）[7]；灰分含量测定采用 550 ℃灼烧法（GB 5505—85）[8]；蛋白酶活力测定采用福林酚法[9]；氨基酸含量测定采用氨基酸全自动分析仪。

1.2.3 蛋白质回收率测定[10]标准曲线的绘制用考马斯亮蓝法[6]。样液组分氮含量＝（A样/A标）×C标。其中，A样代表样品的吸光度值，A标代表标准品的吸光度值，C标代表标准品的浓度。用凯氏定氮法分别测定上清液和酶解液中蛋白氮含量，并按下式计算：蛋白质回收率＝（上清液总蛋白氮量÷原料总蛋白氮量）×100%。

1.2.4 中性蛋白酶优化试验因素和水平 在单因素试验结果基础上，综合考虑4个因素对蛋白质回收率影响，采用Box-Behnken设计方案进行响应曲面研究，建立贻贝蛋白提取率的二次多项式数学模型。pH值，加酶量，酶解温度，酶解反应时间 4 个自变量分别以 X1，X2，X3，X4表示（表1）。

表1 中性蛋白酶优化试验因素和水平设置

2 结果与分析

2.1 贻贝的一般营养成分分析

称取一定量的贻贝，分别测定蛋白质、脂肪、灰分、水分等指标，取平均值（表2）。

表2 贻贝主要成分分析

从表2可以看出，贻贝具有高蛋白、低脂肪的特点，与现代人的食品营养要求比较吻合，具有较广的消费市场和较好的前景。由于其水分含量高，营养丰富，所以极易腐败变质，不易存储。因而，研究其酶解也是非常具有现实意义的。

2.2 4种外加蛋白酶酶解效果的比较

木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胃蛋白酶作为外加蛋白酶，在贻贝的酶解中使用较多，本研究将4种酶进行比较（图1）。

由图1可知，不同蛋白酶酶解贻贝匀浆液的蛋白质回收率存在着较大的差异。酶解时间为120min时，中性蛋白酶的酶解物显示出强的蛋白质回收率，达51.85%；当酶解时间分别为180，240，300min时，中性蛋白酶的酶解物都表现出最强蛋白质回收率，其分别为51.95%，64.58%，71.87%。酶解时间为300min时，各蛋白酶酶解物的蛋白质回收率都达到最高，故筛选出中性蛋白酶酶解贻贝蛋白。

2.3 中性蛋白酶酶解贻贝单因素试验

分别准确称取5 g贻贝匀浆液，置于5个250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比为 1∶3，用 pH 计校正 pH 值为 5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，在45℃恒温水浴锅中提取180min。然后沸水浴灭酶10min，冷却至室温，8 000 r/min离心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同样的上清液0.5mL分别定容至50mL，用考马斯亮蓝法在λ＝595 nm处测吸光度。重复3次，得蛋白质回收率。由图2可知，中性蛋白酶在pH值为6.5时，其对贻贝蛋白质的回收率最大，可达71.05%。

分别准确称取5 g贻贝匀浆液，置于5个250mL三角瓶中，中性蛋白酶按照0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，料液比为 1∶3，用 pH计校正pH值至6.5。在45℃恒温水浴锅中提取180min。然后沸水浴灭酶10min，冷却至室温，8 000 r/min离心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同样的上清液0.5mL分别定容至50mL，用考马斯亮蓝法在λ＝595 nm处测吸光度。重复3次，得到蛋白质回收率。

从图3可以看出，中性蛋白酶在加酶量为0.6%时，其对贻贝蛋白质的回收率可达71.34%。

分别准确称取5 g贻贝匀浆液，置于5个250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比为1∶3，用pH计校正 pH值至6.5。在 35，40，45，50，55℃恒温水浴锅中提取180min。然后沸水浴灭酶10min，冷却至室温，8 000 r/min离心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同样的上清液0.5mL分别定容至50mL，用考马斯亮蓝法在λ＝595 nm处测吸光度。重复3次，得蛋白质回收率。由图4可知，中性蛋白酶在45℃时，其对贻贝蛋白质的回收率最大，达71.35%。

分别准确称取5 g贻贝匀浆液，置于5个250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比为 1∶2，1∶2.5，1∶3，1∶3.5，1∶4，用 pH 计校正pH值至6.5。在45℃恒温水浴锅中提取180min。然后沸水浴灭酶10min，冷却至室温，8 000 r/min离心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同样的上清液0.5mL分别定容至50mL，用考马斯亮蓝法在λ＝595 nm处测吸光度。重复3次，得蛋白质回收率。从图5可以看出，中性蛋白酶在料液比为1∶3时，其对贻贝蛋白质的回收率最大，为71.02%。

分别准确称取5 g贻贝匀浆液，置于5个250mL三角瓶中，加入0.6%中性蛋白酶，料液比为1∶3，用pH计校正pH值至6.5。在45℃恒温水浴锅中提取时间分别为60，120，180，240，300min。然后沸水浴灭酶10min，冷却至室温，8 000 r/min离心10min，取上清液，去掉沉淀。吸取不同样的上清液0.5mL分别定容至50mL，用考马斯亮蓝法在λ＝595 nm处测吸光度。重复3次，得蛋白质回收率。由图6可知，中性蛋白酶在180min时，其对贻贝蛋白质的回收率可达72.08%。但是随着时间的延长，虽然蛋白质回收率提高了，可贻贝水解液的风味产生变化，综合考虑应选用水浴水解180min。

2.4 中性蛋白酶酶解条件的优化

利用design expert和SAS程序对试验进行处理分析，回归方程的方差分析、各项的方差分析和参数估计及显著性分析的主要结果列于表3～5。

表3 响应面试验结果

表4 回归方程的方差分析

表5 回归方程的各项方差分析

二次回归模型F值为17.777 0，P＜0.001 0；大于在0.01水平上的F值，而交互项的F值为3.393 0，小于在0.05水平的F值，说明该模型拟合结果好，一次项、二次项和交互项的F值均大于0.01水平上的F值，说明各个因素之间的交互作用都对蛋白质回收率有极其显著的影响。

贻贝蛋白的蛋白质回收率方程为：Y＝273.205 833＋49.206 667X1＋28.054 167X2＋6.235 500X3－0.385 472X4－4.907 500X12－2.425 000X2X1－34.703 125X22＋0.145 500X3X1＋0.300 000X3X2－0.059 375X32－0.011 250X4X1＋0.051 250X4X2－0.006 325X4X3－0.001 517X42。

方程的显著性分析的F1＝17.777 0，相应的P值为0.000 0，失拟性检验分析的F2＝1.118 0，相应的P＝0.426 0。由方程的显著性检验可知，该方程的模型达到极显著；失拟性分析表明，该回归方程无失拟因素存在，回归模型与实测值能较好地拟合。

2.5 响应面分析及提取条件的优化

由图7，8可知，等高线都为椭圆形，说明pH值和温度以及温度和加酶量两两之间的交互作用明显，都对蛋白质的回收率有影响。

由图9～12可知，贻贝蛋白的蛋白质回收率是先增加后降低，等高线的形状反映出时间和加酶量，时间和pH值，时间和温度，加酶量和pH值两两之间的交互作用较弱，响应面比较陡峭说明蛋白质回收率对时间、加酶量、温度、pH值的变化敏感[11-13]。

为了进一步求得各因素的最佳条件组合，通过对模型方程的求解，得到曲面的最大值为72.2%。通过以上各图，绘出各因素对应的三维拟合面与等高线，证实了响应面具有最大值。并且回归方程求导[14]，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即4个主要因素的最佳水平值，转换后得到提取的最佳条件为 X1＝6.3，X2＝0.75，X3＝42.9，X4＝184.9。最优提取条件和蛋白质回收率如表6所示。

蛋白质回收率最高时的条件：pH值、加酶量、酶解温度和反应时间的具体值分别为6.3，0.75%，42.9 ℃，184.9min，该条件下得到的最大蛋白质回收率为72.2%。为了检测该模型预测的可靠性，按优化条件进行验证试验，得到预测与试验的偏差值为0.29%，说明响应面优化得到的试验参数是可靠的。

表6 中性蛋白酶提取优化值及最优条件下最大蛋白质回收率

2.6 中性蛋白酶酶解前后氨基酸的变化

贻贝未加酶水解测定的氨基酸的结果为原料中氨基酸含量，经过中性蛋白酶水解后的氨基酸含量为酶解后氨基酸的回收率（表7）。

表7 中性蛋白酶酶解过程中氨基酸的变化

利用中性蛋白酶酶解贻贝，前后氨基酸的总量有所变化，有的含量上升，有的下降，这是因为贝类中的氨基酸包括蛋白质中的氨基酸和游离氨基酸，提取蛋白质产生的氨基酸和贝类本身含有的游离氨基酸混合在一起，所以会出现有的氨基酸含量增加，有的氨基酸含量减少的现象。

3 结论

利用响应面法对蛋白酶提取贻贝蛋白质回收率的关键因子进行优化。建立了蛋白质回收率与4个关键因子（pH值、加酶量、温度和时间）的二次多项回归模型，经过验证是合理可靠的。同时利用响应面对关键因子及其相互作用进行了分析，得出酶解条件是pH值为6.3，加酶量为0.75%，酶解温度42.9℃和184.9min的酶解时间时，贻贝蛋白的最大蛋白质回收率为72.2%。贻贝酶解前后氨基酸的总量变化了1.453%。该研究可以为有效科学地酶解贻贝蛋白提供重要的技术基础。

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