不同转染试剂转染绵羊成纤维细胞效果比较

黄 洋，靳 辉，吕丽华，张春香

（山西农业大学动物科技学院，山西太谷030801）

GDF-8（Growth and Differentiation Factor-8）最早于1997年McPherron等[1]研究小鼠骨骼肌cDNA文库时发现，它是一种对骨骼肌生长具有负调控作用的细胞因子，该基因的突变或敲除会使动物生长速度加快、肌肉含量升高、脂肪含量减少。GDF-8基因发生自然突变的双肌牛——比利时蓝牛[2]，其肌肉数量比一般品种多20%，且肉质鲜嫩。因此，建立敲除GDF-8基因的转基因动物具有非常广阔的应用前景。

本研究分别用LipofectamineTM2000与Fu-Gene HD这2种转染试剂介导携带有绿色荧光蛋白基因标记的GDF-8基因干扰质粒转染绵羊成纤维细胞，探索其最佳转染效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 表达载体与菌种 绿色荧光蛋白标记的GDF-8基因干扰质粒和大肠杆菌DH5α，为山西农业大学动物科技学院遗传育种与繁殖实验室保存。

1.1.2 试 剂 DMEM/F12（Boster），Opti-MEM，FBS（GIBCO），胰蛋白酶（Solarbio），双抗（Sigma），LipofectamineTM2000 （invitrogen），FuGene HD（Roche）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养液配制 基本培养液：在DMEM/F12中添加10%FBS和1%双抗，此培养液用于绵羊成纤维细胞的原代培养和传代培养。无抗培养液：在DMEM/F12中添加10%FBS，此培养液用于质粒的转染。

1.2.2 绵羊成纤维细胞培养 取1周龄绵羊耳组织，用组织块贴壁培养法进行原代培养、传代培养和冻存，建立绵羊成纤维细胞系[3-7]，为质粒转染提供靶细胞。

1.2.3 转染

1.2.3.1 LipofectamineTM2000介导质粒转染绵羊成纤维细胞条件优化 将传至4代已经纯化的绵羊成纤维细胞接种于96孔板中，接种密度为1×104个/孔。当细胞汇合至约70%时，将基本培养液换为无抗培养液，继续培养24 h，此时细胞汇合度已达到90%。

优化步骤：（1）将不同量的质粒 DNA（0.1，0.2，0.4，0.6μg） 和不同量的 LipofectamineTM2000（0.1，0.5，1.0，1.5μL）分别稀释于25μL的Opti-MEM中，然后将稀释好的质粒DNA和LipofectamineTM2000两两混合构成50μL转染液，进行转染，共16个处理。转染12 h后，弃掉转染液，更换为基本培养液，继续培养48 h后，在荧光倒置显微镜下检测每个处理表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数。检测时每个转染处理组随机选取5个视野，检测表达绿色荧光蛋白的阳性细胞数，取其平均值。（2）用筛选出的最佳质粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量构成转染液，将转染时间设定为 3，6，12，24，48 h，然后弃掉转染液，更换为基本培养液，继续培养48 h后，荧光倒置显微镜下检测不同转染时间的阳性细胞数，用以筛选最佳转染时间。

1.2.3.2 FuGene HD介导质粒转染绵羊成纤维细胞条件优化 将传至第4代已经纯化的绵羊成纤维细胞接种于96孔板中，接种密度为1×104个/孔。按照FuGene HD试剂说明书要求控制质粒DNA的量，筛选FuGene HD用量以及转染液的用量。操作步骤为：（1）将2μg质粒DNA分别和 6，8，10，12 μLFuGene HD混合后，加入Opti-MEM构成4个梯度的转染液，使得每个梯度转染液终体积为100μL。（2）每孔中加入转染液的量分别定为 5，10，20，40μL，进行转染。不更换转染液，转染48 h后，荧光倒置显微镜下检测转染阳性细胞数。

2 结果与分析

2.1 Lipofectam ineTM 2000介导质粒转染绵羊成纤维细胞优化结果

2.1.1 最佳质粒DNA用量和LipofectamineTM2000用量 试验结果（图1）表明，当质粒DNA用量为0.4μg，LipofectamineTM2000用量1.0μL时，转染效率最高，与其他处理之间差异达极显著水平（P＜0.01）。

2.1.2 转染的最佳时间 按照2.1.1筛选出的最佳质粒DNA和LipofectamineTM2000用量，继续筛选最佳转染时间。结果（图2）表明，转染时间为6 h时，可以获得最高的转染效率，与转染时间为12 h时差异显著（P＜0.05），与其余处理之间差异极显著（P＜0.01）。

2.2 FuGene HD介导质粒转染绵羊成纤维细胞条件优化结果

结果（图3）表明，当每100μL转染液内含2μg质粒DNA与10μLFuGene HD，每孔内加入转染液5μL时能获得最佳转染效果，与其余处理之间差异显著（P＜0.05）。

2.3 Lipofectam ineTM 2000与FuGene HD转染效率比较

将以上筛选的LipofectamineTM2000最佳转染条件下的转染效率与FuGene HD转染效率比较，结果（图4）表明，FuGene HD转染效率极显著高于 LipofectamineTM2000（P＜0.01）。荧光倒置显微镜观察这2种转染试剂的转染效果如图5、图6所示。

3 讨论

脂质体是借助超声处理使复合脂质在水溶液中膨胀形成的一种连续的双层或多层复合脂质组成的人工小球囊，其表面带有正电荷，能吸附DNA的磷酸基团和带负电荷的细胞膜。然后通过胞吞作用，使得脂质体与DNA的复合物进入细胞，最终外源基因将会整合到细胞基因组上进行表达。LipofectamineTM2000是一种常用的商品化阳离子脂质体转染试剂，由几种阳离子脂质体混合而成。对于多种细胞有较高的转染效率，在基因转染的研究中已有很多文献[8-11]报道。

转染试剂将外源核酸片段导入细胞的同时，也将影响内源基因表达水平，从而对细胞的代谢和状态造成不利影响，或影响试验数据的客观性，这称为Off-target效应。FuGene HD的这种效应明显低于LipofectamineTM2000，即FuGene HD的毒性小于LipofectamineTM2000。

体细胞介导转基因技术是克隆技术的进一步成熟和完善，它为家畜的遗传改良提供了一条新的途径。对于用转基因体细胞克隆的方法生产转基因动物来说，从细胞转染开始到获得阳性克隆细胞，至少需要传10代左右。因此，转染试剂对细胞所造成的微小伤害都会对细胞造成严重影响。FuGene HD不但对细胞毒性低，而且试验结果表明，FuGene HD对于绵羊成纤维细胞的转染效率明显高于LipofectamineTM2000。在体细胞介导转基因技术中，FuGene HD不失为一种优良的转染试剂，具有良好的应用前景。

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