不同橘核炮制品中柠檬苦素和诺米林的测定

何中燕， 裴 瑾*， 莫书蓉， 刘 瑛， 潘晓丽

(1．成都中医药大学药学院中药材标准化教育部重点实验室，四川成都610075;2．成都大学医护学院，四川成都610015)

橘核为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥成熟种子，具有理气，散结，止痛的功效，用于疝气疼痛，睾丸肿痛，乳痈乳癖［1］。关于橘核历代有多种炮制方法，如宋代和明代有炒法，《证类本草》中记载:“炒研为末。”、《普济方》中记载:“炒令黄色，去壳，为末。”，清代在炒法的基础上又增加了盐炒、炒焦、青盐拌炒、酒焙和盐酒炒等方法，其中酒制法近代已不复用。除了上述各种外，近代又出现了麸炒和盐炙两种新的炮制方法，其中盐炙法似系清代的盐炒法衍变而来［2］。现代研究表明，橘核中主要的活性成分为柠檬苦素类化合物，该类化合物具有明显的抗肿瘤［3-4］，镇痛抗炎［5］以及杀虫［6］等药理作用。目前已分离得到了约300多种柠檬苦素类化合物，柑橘属中有50多种，其中包括38种柠檬苦素类似物苷元和20种配糖体［7］，目前检测此类化合物的方法主要有 TLC法［8］、UV法［9］、HPLC法［10］等，柠檬苦素和诺米林在橘核中的质量分数最高［11］，故本研究选择此两种有效成分作为指标成分，对中药橘核现代常用的几种炮制品(生品，麸炒品，清炒品，盐炙品)进行较为准确的HPLC测定，探讨炮制后成分变化，为其质量评价提供一定依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器 岛津高效液相色谱仪(LC-10AVP)和浙江N2000色谱工作站。

1．2 试药 柠檬苦素及诺米林对照品均购于四川维克奇生物科技有限公司(经HPLC检查纯度大于98%)，所用试剂甲醇为色谱纯，其余为分析纯，重蒸水;炮制用橘核药材购于成都荷花池药材市场，所有药材经成都中医药大学药学院药植与鉴定教研室裴瑾教授鉴定。

2 样品制备

2．1 生橘核 取净橘核适量，粉碎过三号筛备用。

2．2 清炒橘核 取净橘核适量，依药典2010年版附录ⅡD清炒法进行，得到清炒橘核，粉碎过三号筛备用。

2．3 麸炒橘核 取净橘核适量，依药典2010年版附录ⅡD麸炒法进行，得到麸炒橘核，粉碎过三号筛备用。

2．4 盐炙橘核 取净橘核适量，依药典2010年版附录ⅡD盐炙法进行，得到盐炙橘核，粉碎过三号筛备用。另购市售盐炙橘核四批，粉碎过三号筛备用。

3 方法与结果

3．1 色谱条件 色谱柱为迪马C18(250 mm×4．6 mm);流动相:甲醇-水(65 ∶35);柱温:室温;体积流量:1．0 mL/min;检测波长:210 nm;进样量:10 μL。

3．2 对照品溶液的制备 精密称取柠檬苦素对照品4．94mg和诺米林5．11mg，分别置于10 mL量瓶中，用色谱甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为母液备用。

3．3 样品溶液制备 取橘核粉末0．5 g，精密称定，置250 mL圆底烧瓶中，加30 mL石油醚(60～90℃)于70℃水浴回流脱脂4 h，过滤，弃去石油醚，残渣加50 mL二氯甲烷于50℃水浴回流提取1 h，过滤，取滤液将其放入蒸发皿中挥干，加色谱甲醇定容至10 mL，摇匀，过滤(0．45 μm 微孔滤膜)，取续滤液备用。

3．4 方法学研究

3．4．1 线性关系的考察 取一定量配制好的标准溶液母液稀释，配制成一系列浓度梯度的标准溶液，使得柠檬苦素和诺米林的质量浓度分别为0．0494 mg/mL、0．0988 mg/mL、0．1976 mg/mL、0．3952 mg/mL、0．494 0 mg/mL 和 0．0511 mg/mL、0．1022 mg/mL、0．2044 mg/mL、0．3066 mg/mL、1．0220 mg/mL。按上述色谱条件进样10μL，得到以峰面积Y对柠檬苦素和诺米林浓度X(mg/mL)的线性回归方程分别为 Y=3E+06X+72320，R2=0．9993 和 Y=3E+06X+99240，R2=0．9974。结果表明柠檬苦素在0．0494～0．4940 mg/mL 范围内，诺米林在 0．0511～1．0220 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

3．4．2 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液分别进样10μL，连续重复5次，以测得的柠檬苦素和诺米林的峰面积A为指标，计算相对标准偏差(RSD)，以考察方法的精密度，求得柠檬苦素和诺米林RSD值分别为1．23%和0．89%，结果表明方法的精密度良好。

3．4．3 重现性试验 取同一批橘核药材粉末0．5 g，5份，精密称定，按3．3 项下制备，进样10 μL，以测得的柠檬苦素和诺米林的峰面积A为指标，计算相对标准偏差(RSD)，以考察方法的重现性，求得柠檬苦素和诺米林RSD值分别为0．80%和1．16%。

3．4．4 稳定性试验 取橘核药材粉末0．5 g，精密称定，按3．3 项下制备，于 0、2、4、8、12 h 各进样 10 μL，以测得的柠檬苦素和诺米林的峰面积A为指标，计算相对标准偏差(RSD)，以考察供试品溶液的稳定性，求得柠檬苦素和诺米林 RSD值分别为1．21%和1．92%，结果表明供试品溶液在12 h内稳定。

3．4．5 回收率试验 采用加样回收法，取橘核药材粉末5份，精密称定，分别加入一定量柠檬苦素和诺米林对照品，按3．3项下制备并测定，计算柠檬苦素的平均回收率为99．92%，RSD值为1．27%(n=5)。诺米林的平均回收率为100．10%，RSD值为1．18%(n=5)。

3．5 样品的测定 取各炮制品，按样品溶液制备项下制备，进样10 μL，结果见表1，图1、2。

表1 橘核生品及各种炮制品中柠檬苦素、诺米林测定结果(n=3)Tab．1 Cam parison of limonin and nom iln of different processed products of tangering seed

图1 对照品柠檬苦素、诺米林的HPLC图Fig．1 HPLC Chromatogram of limonin and nom ilin reference substance

图2 橘核生品及各炮制品HPLC图Fig．2 HPLC chromatogram of diffdrent processed products of tangerine seed

4 讨论

4．1 不同炮制方法对橘核中柠檬苦素和诺米林的量均有显著的影响。自制的各种炮制品与生品1比较，柠檬苦素和诺米林量均出现了不同程度的降低，尤其是盐炙品和清炒品其柠檬苦素和诺米林总量仅分别为生品的72．5%、80%，但柠檬苦素与诺米林的比值变化不大。据文献报道，温度、pH值等是影响柠檬苦素类似物稳定性的重要因素［11］，在炮制过程中橘核受热，柠檬苦素和诺米林的结构发生变化转化为其他柠檬苦素类物质导致其量降低。由于盐炙、清炒是直接受热，故量降低最多，麸炒由于麦麸的隔热作用，降低较少。

4．2 3个批次橘核生品中柠檬苦素和诺米林的总量均高于1%，且相差不大，但柠檬苦素与诺米林量的比值有较大差异(1．71 ～2．64)。

4．3 传统中医理论认为橘核盐炙过后会增强治疗疝、乳腺肿痛的作用，也有现代研究报道盐炙橘核较生品橘核的镇痛抗炎作用更强［12］。课题组经调查证实，目前临床使用也以盐橘核为主。但是本次实验表明，不同来源批次的盐炙品柠檬苦素和诺米林的量有显著差异(柠檬苦素与诺米林之和0．65% ～1．33%，柠檬苦素/诺米林之值 1．71 ～ 2．78)，为保证临床用药的安全有效，进行中药饮片的质量控制势在必行。

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