土鳖虫超微粉体中游离氨基酸的测定及指纹图谱研究

蔡 萍， 万 丹， 肖 娟， 张水寒， 蔡光先

(湖南省中医药研究院，湖南省中药粉体与创新药物省部共建重点实验室，湖南省教育厅中药粉体技术创新团队，湖南长沙410013)

土鳖虫，又称地鳖虫，在我国具有悠久的药用历史。其雌虫体具有散血瘀、消坚结、解凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效。在我国，常用于入药的土鳖虫有地鳖 Eupolyphaga sinensis Walker、冀地鳖 Steleophaga plancyi(Boleny)和金边土鳖Opishoplatia orientalis Burmeister［1］。土鳖虫中含有丰富的氨基酸［2-4］。目前，用柱前衍生化法分析土鳖虫氨基酸的报道还未见，本实验采用PITC柱前衍生化高效液相色谱法检测土鳖虫中的游离氨基酸，为评价土鳖虫超微粉体内在质量提供一定的参考依据。

1 实验仪器、试药与药材

1．1 仪器 岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪，配置SPD-M10AVP型二极管阵列检测器、CTO-10ASVP柱温箱，CLASS-VP岛津工作站;KQ3200型超声波清洗器(220V，40KHz);BFM-T6BI“贝利”微粉机(济南贝利粉碎技术工程有限公司);旋涡混合器:金坛市大地自动化仪器厂;T-214型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1．2 试剂 甲醇、乙腈(色谱纯，Tedia公司生产)，冰醋酸(色谱纯，天津市科密欧化学试剂开发中心)，异硫氰酸苯酯(PITC)(上海金山亭新化工试剂厂)，无水乙酸钠、三乙胺、正己烷均为恒兴试剂，水为重蒸馏水，其它试剂均为分析纯。

1．3 对照品 天冬氨酸 Asp，谷氨酸 Glu，丝氨酸Ser，甘氨酸 Gly，组氨酸 His，精氨酸 Arg ，丙氨酸Ala，脯氨酸 Pro，缬氨酸 Val，酪氨酸 Tyr，异亮氨酸Ile，亮氨酸 Leu，色氨酸 Trp，苯丙氨酸 Phe，赖氨酸Ly，上述氨基酸对照品均购于Sigma公司。

1．4 药材 10批土鳖虫药材分别购自四川、广西、湖南、陕西、江西、安徽等地(见表1)，经湖南中医药研究院生药鉴定室鉴定为地鳖、冀地鳖及金边土鳖虫雌体，加工成超微粉体。土鳖虫对照药材(批号:121489-200602)。土鳖虫经贝利粉碎机超微粉碎后，粒径检测采用Winner 3001干粉激光粒径仪，结果D50均值为12．285μm，小于75μm的颗粒累积在95%以上。

表1 10批土鳖虫的来源Tab．1 Ten batches of Eupolyphaga from different sources

2 实验方法与结果

2．1 色谱条件［5-7］色谱柱为依利特 Hypersil C18BDS柱(4．6 mm ×250 mm，5 μm)，流动相 A 乙腈-水(4∶1)，B 醋酸钠缓冲溶液(pH=6．5)-乙腈(97∶3)，检测波长为254 nm，体积流量为 1 mL/min，柱温为30℃。按表2进行梯度洗脱。

表2 梯度洗脱程序Tab．2 The gradient elution

2．2 供试品溶液的制备及衍生化 称取样品及对照药材各0．4 g，精密称定，准确加入25 mL 50%甲醇，称定质量，超声提取30 min，放至室温，再称定质量，补足减失的质量，离心，取上层液2 mL，置于10 mL离心管内，加入 0．1 mol/L异硫氰酸苯酯(PITC)-乙腈溶液(12 ∶988)1 mL，1．0 mol/L 三乙胺-乙腈溶液(139∶861)1 mL，漩涡混合1 min，暗处放置1 h，再加入正己烷4 mL，漩涡混合1 min，静置10 min，吸取下层溶液过0．45μm微孔滤膜过滤，备用。

2．3 对照品溶液的制备及衍生化 分别称取各氨基酸对照品适量，用50%甲醇溶解配制成混合对照品溶液，吸取对照品溶液2 mL，照上法进行衍生化处理，即得。

2．4 空白溶液的制备及衍生化 取50%甲醇溶液2 mL，照上法进行衍生化处理，即得。

2．5 方法学考察

2．5．1 指纹图谱的建立 分别精密吸取混合对照品溶液、空白溶液、对照药材溶液、供试品溶液各5 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录52 min的色谱图，见图1。

2．5．2 精密度试验 精密吸取2．3项下的混合对照品溶液，连续重复进样5次，其相似度大于0．99，符合指纹图谱的要求。

2．5．3 稳定性试验 取2．2项下的同一份供试品溶液(NO．1 海川)，分别在制备后0、2、4、6、8、12、24 h进样5μL，结果显示，其相似度大于0．98，表明样品24 h内稳定，符合指纹图谱的检测要求。

2．5．4 重复性试验 取同一批土鳖虫超微粉体样品(NO．1海川)5份，分别按2．2项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样5μL，结果显示，其相似度大于0．97。表明此方法的重复性良好。

2．6 指纹图谱的建立

图1 土鳖虫游离氨基酸HPLC图谱Fig．1 HPLC chromatogram of free am ino acids in Eupolyphaga

2．6．1 共有指纹峰的标定 按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》规定［8］，采用相对保留时间标定共有指纹峰，以图谱中11号峰(脯氨酸)作为参照峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的比值，共有色谱峰24个，共有峰峰面积占总峰面积均在80%以上，各峰相对保留时间的 RSD% 分别为 0．49%、0．63%、0．39%、0．43%、0．32%、0．29%、0．22%、0．13%、0．13%、0．08%、0．00%、0．03%、0．18%、0．24%、0．25%、0．25%、0．30%、0．35%、0．52%、0．85%、0．43%、0．38%、0．45%、0．32%。

2．6．2 指纹图谱的相似度计算 采用中国药典委员会出版的《中药色谱指纹图谱相似度评价》软件(2．0版)对10批不同产地土鳖虫超微粉体进行相似度评价。设置第一批样品图谱为参照物图谱，时间窗0．5，中位数法，多点校正后自动匹配，生成对照指纹图谱(见图2)，10批样品的相似度达到0．95以上，相似度计算结果见表3。

图2 10批土鳖虫超微粉体的HPLC图谱Fig．2 HPLC fingerprint of 10 batches of samples

表3 10批土鳖虫超微粉体指纹图谱相似度结果Tab．3 The sim ilarity evaluation of Eupolyphaga for 10 batches of samples

2．7 氨基酸测定 土鳖虫超微粉体线性关系考察、加样回收试验及定量测定 分别取甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸对照品，配制成质量浓度分别为 0．012 6、0．068 0、0．019 5、0．072 0、0．015 2、0．015 6 mg/mL 的对照品溶液，按2．3 项进行处理，按上述色谱条件进样，以氨基酸对照品峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。见表4。精密称取已知氨基酸量的土鳖虫超微粉体6份，分别加入适量的甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸，按2．2项下方法制备供试品溶液，计算回收率。结果，甘氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、赖氨酸的平均回收率分别为 90．26% 、92．53% 、91．22%、96．20%、95．57% 和 98．27%。RSD% 分别 2．1%、1．8%、2．5%、2．4%、3．2%、1．2%。根据线性回归方程，计算10批土鳖虫超微粉体中6种氨基酸。见表5。

表4 6种氨基酸线性关系Tab．4 Linear relationship of six kinds of free am ino acids

表5 10批土鳖虫超微粉体的6种氨基酸测定结果Tab．5 Content of six kinds of free am ino acids in 10 batches of samples

3 讨论

3．1 测定方法的选择 柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸分析时间较短、方法灵活多样、灵敏度高，据报道目前主要的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、异硫氰酸苯酯 (PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC)等［9-11］。其中用PITC柱前衍生采用常规C18柱、UV检测器就可以检测，且产物稳定。所以本实验采用此试剂进行柱前衍生化进行氨基酸的检测。

3．2 提取方法的考察 分别用回流及超声的提取方法对样品进行处理，但回流后的样品与衍生化试剂反应后有白色浑浊物生成，影响实验结果，所以本实验采用超声的提取方法;提取溶剂分别考察水、50%甲醇、甲醇，考虑到氨基酸易长菌降解［12］，且用50%甲醇提取液衍生化后，分离效果好，出峰数多，故采用50%甲醇溶液作为提取溶液。

3．3 进样量的选择 试验中曾尝试进样量10μL、8μL，但对照品溶液及供试品溶液中天冬氨酸和谷氨酸峰都会分叉，其他峰均正常，当进样量改为5 μL时，未出现这种情况，可能是因为色谱柱超载［13］。

3．4 记录时间的选择 按上述色谱条件进样，参照混合对照图谱及空白图谱，可知在52 min后均为衍生化试剂峰，且峰形杂乱，故确定记录时间为52 min。

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