Wip1在肺癌细胞中的作用机制初探*

赵吉星， 鲁建军， 孙 磊， 罗红鹤， 顾 勇

(中山大学附属第一医院胸外科，广东广州510080)

Wip1(wild－type p53－induced phosphatase 1)，即野生型p53介导的蛋白磷酸酶，它与p53有着密切的关系[1，2]。Wip1在WMN(wt－p53)细胞核内表达，是一种核蛋白[3]。小鼠与人Wip1氨基酸序列同源性约为86%，在小鼠体内各脏器中均检测到该基因的表达，尤其在睾丸中表达量明显增高，且在细胞减数分裂和胚芽分化过程中有重要作用[4]。p53基因是一种抑癌基因，在正常细胞受到各种应激作用导致DNA损伤时，p53基因被激活，进行DNA损伤修复和介导细胞凋亡过程。p53基因功能被抑制时，可以导致肿瘤的发生。是否Wip1可以抑制p53的功能而导致肿瘤的发生?Wip1基因是一种原癌基因[5]。2004年 Bulavin等[6]对 Wip1基因做了进一步研究证明Wip1基因缺失可以抑制细胞的癌变。目前已经证实在胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]、乳腺癌[10]、神经母细胞瘤[11]、卵巢透明细胞癌[12]、成神经管细胞瘤[13]和胃癌[14]中Wip1高表达，通过抑制p53基因功能而导致肿瘤的发生。细胞DNA损伤激活ATM/ATR下游重要靶蛋白磷酸化，研究证实ATM/ATR启动的损伤修复对阻止肿瘤发生有重要意义[15]。高表达的Wip1可能通过降低ATM依赖的信号级联活性，抑制DNA损伤的修复而导致肿瘤发生[16]。DNA损伤时，ATM使Chk2磷酸化，阻止肿瘤的发生。而Wip1与Chk2结合使其去磷酸化使得Chk2失活，导致肿瘤发生。体内外实验证实Wip1也可以抑制Chk1磷酸化而导致肿瘤的发生[17]。

目前认为Wip1至少通过4种机制抑制p53的活性:(1)直接作用于p53使其N端第15位氨基酸残基去磷酸化而失活[18];(2)间接通过p38MAPK去磷酸化，使得下游p53蛋白的第33和46位丝氨酸残基磷酸化过程受阻而失活[19];(3)通过Chk1去磷酸化后使得下游p53蛋白第20位丝氨酸残基去磷酸化而失活[18];(4)通过p38MAPK去磷酸化途经进一步抑制p19 ARF蛋白表达，激活下游MDM2与p53的结合，从而使得p53转录调节功能失活[6]。这4种机制当中，p38 MAPK信号通路更成为当前的研究热点。由 Wip1、p38 MAPK和p53形成的负反馈通路，在肿瘤的形成中发挥着重要作用[6]。在乳腺癌中也证明过表达的Wip1通过Wip1/p38 MAPK/p53信号通路使内环境失调[20]。当应用 ATO阻滞Wip1的1条作用途径Wip1－p38 MAPK－p53后，也可加剧白血病细胞的凋亡[21]。

本课题组的前期实验证明Wip1在肺癌细胞及组织中过表达[22]，而对Wip1在肺癌细胞中的作用途径的研究国内外尚未见报道。本实验应用Western blotting检测肺癌细胞中是否有Wip1－p38 MAPK－p53途径的失衡，探讨Wip1在肺癌中的作用机制。

材料和方法

1 细胞

人肺腺癌细胞A549和人大细胞肺癌细胞NCI－H460购自中山大学实验动物中心;人鳞癌细胞NCI－1299购自广州十环医药公司;人正常支气管上皮细胞HBE购自湖南远泰生物技术有限公司。

2 主要试剂

RPMI－1640培养基(Gibco);胰酶、PBS 、DMSO、BSA、脱脂奶粉、丙稀酰胺(广州威佳);胎牛血清(Gibco);RIPA裂解液(上海申能博彩);苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF，Sigma);BCA蛋白定量试剂盒(碧云天);Protein marker(MBI Fermentas);兔抗人 Wip1多克隆抗体(Santa Cruz);兔抗人p－p53(Ser46)单克隆抗体(Cell Signaling);兔抗人 p－p38 MAPK(Thr180/Tyr182)单克隆抗体(Cell Signaling);兔抗人p53单克隆抗体、兔抗人p38 MAPK单克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG单抗(武汉博士德);SuperECL Plus超敏发光液(北京普利莱);X－胶片(Kodak);其它未提及的化学试剂均为市售分析纯。

3 方法

3.1 细胞株的复苏、培养、冻存 从液氮罐中取出冻存管，置于37℃水中，不停摇动以尽快解冻。将细胞悬液转入离心管中，加入10 mL RPMI－1640培养基，离心后去上清。加入2 mL RPMI－1640培养基重悬细胞，转入培养瓶中，另加入6 mL RPMI－1640培养基置CO2孵箱中培养。2－3 d更换1次培养基。细胞常规培养于含10%灭活的胎牛血清，并加入了1%谷氨酰胺及1%青霉素和链霉素的RPMI－1640培养液中，放置于37℃、饱和湿度、5%CO2的孵箱中孵育;每2－3 d换液1次;用消化液常规消化传代。取对数期细胞进行实验。细胞密度至80%时，收集细胞到离心管中，1 000 r/min离心10 min。弃上清，加入冻存液，轻吹打成均匀细胞悬液，移入冻存管中，4℃放置约30 min，－20℃放置约30 min，置－80℃冰箱，第2 d移入液氮长期保存。

3.2 Western blotting检测细胞Wip1－p38MAPK－p53通路蛋白的表达 总蛋白的提取，收集对数生长期的细胞，PBS洗涤2次。在细胞中加入RIPA裂解液(强)，约每2×106个细胞加RIPA裂解液150 μL，并在临用前加入PMSF，使其终浓度为1 mmol/L。在冰上裂解15 min，4℃、15 000 r/min离心30 min。取上清保存于－80℃冰箱中备用。取部分上清以BCA法测定蛋白浓度，并调节各组蛋白浓度。蛋白浓度测定，配制工作液:根据标准品和样品的数量，将BCA reagent A∶BCA reagent B按50∶1的体积配制工作液，充分混合均匀。稀释标准品及样品:在96孔板中加入标准品及双蒸水，样品稀释10倍后每孔加入25 μL，然后在各孔内加入200 μL工作液，混合均匀，37℃放置30 min。冷却到室温后，在紫外分光光度计上于595 nm处测定吸光度值，以标准蛋白质的不同浓度为横坐标，每一浓度所对应的吸光度值为纵坐标，做标准曲线;从曲线上找出样品蛋白质所对应吸光度值和浓度，该浓度乘以样品的稀释倍数即得样品的原始浓度。蛋白质SDS－PAGE电泳，制胶:将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，晾干。配制10%分离胶和5%浓缩胶。灌胶:将分离胶小心移入垂直电泳槽至2/3处。加入ddH2O压胶。待分离胶凝固后小心移去ddH2O，灌制浓缩胶，插梳。上样:灌好浓缩胶1 h后拔除梳子，拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔2遍以去除残胶。取调定好浓度的蛋白加入5×上样缓冲液煮沸5 min，然后加样。电泳:垂直电泳的条件为浓缩胶100 V，分离胶200 V。电转移，取胶:将胶卸下，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸，注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分。湿转:电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1 000 mL电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。将电泳槽置于冰水混合物中，电转条件为110 min，200 mA。封闭:将膜从电转槽中取出，TBST漂洗3次，每次10 min，浸没于封闭液中缓慢摇荡，4℃过夜。结合Ⅰ抗:将封闭好的膜放入含Ⅰ抗的封闭液中，室温轻摇1.5 h。洗涤:Ⅰ抗孵育结束后，将PVDF膜从Ⅰ抗封闭液中取出，TBST洗3次，每次10 min。结合Ⅱ抗:将PVDF膜放入HRP标记的羊抗兔IgG单抗封闭液中，室温轻摇1 h。洗涤:Ⅱ抗孵育结束后，用TBST漂洗膜后再浸洗3次，每次10 min。发光鉴定，将膜上的液体控干，置于保鲜膜内，将发光液A液和B液各500 μL混合后涂于膜上，反应2 min。熄灯至可见淡绿色荧光条带后，将保鲜膜固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1－2 min，清水漂洗后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。用凝胶分析软件Image Quant 5.2对图像进行分析。

4 统计学处理

结 果

Western bloting检测Wip1蛋白的表达，用Wip1与内参GAPDH的灰度比值表示表达量。Wip1蛋白在3种肺癌细胞和人正常支气管上皮细胞HBE中均有表达，人肺腺癌细胞A549、人鳞癌细胞NCI－1299和人大细胞肺癌细胞H460中的Wip1蛋白表达水平明显高于HBE细胞，差异显著(P＜0.05)。3种肺癌细胞和HBE细胞中p53蛋白和p38 MAPK蛋白的表达差异无显著(P＞0.05);p－p38 MAPK蛋白和p－p53蛋白在HBE中的表达均高于3种肺癌细胞，差异显著(P＜0.05)，见图1、表1。结果提示肺癌细胞中存在Wip1－p38 MAPK －p53信号通路的失衡(Wip1表达增加，p－p38 MAPK和p－p53表达降低)。

Figure 1.Expression of Wip1－p38 MAPK－p53－related proteins in HBE and lung cancer cells detected by Western blotting.Lane 1:HBE cells;Lane 2:NCI－1299 cells;Lane 3:A549 cells;Lane 4:H460 cells.图1 Western blotting检测HBE及肺癌细胞中Wip1－p38 MAPK－p53通路蛋白的表达

讨 论

Wip1基因是一种原癌基因，已证实在胰腺癌[7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]、乳腺癌[10]、神经母细胞瘤[11]、卵巢透明细胞癌[12]、成神经管细胞瘤[13]和胃癌[14]中 Wip1 高表达，通过抑制p53基因功能而导致肿瘤的发生。我们的前期实验结果也显示:Wip1 mRNA在这些肺癌细胞中的表达水平高于正常支气管上皮细胞，各种肺癌细胞类型中的表达无差异[22]。本实验中我们用Western blotting检测了各类肺癌细胞中Wip1蛋白的表达水平，实验结果显示:Wip1蛋白在肺癌细胞中的表达水平高于正常支气管上皮细胞，各种肺癌细胞类型中的表达无显著差异，与mRNA的表达趋势一致，但表达的差异没有mRNA那么大，可能存在着转录后修饰过程。既然Wip1在肺癌细胞中高表达，那么在肺癌中Wip1主要是通过哪个途径导致了肿瘤的发生呢?我们做了进一步的探索。在4条已知Wip1作用途径中，p38 MAPK是一个重要枢纽，我们重点关注了p38 MAPK信号通路。当细胞受到周围环境的刺激如UV照射后，可使p38 MAPK磷酸化而活化，而活化后的p38 MAPK可磷酸化p53而提高其活性，导致细胞周期的停止或细胞凋亡[23]。Wip1、p38 MAPK和p53通过形成一个负反馈通路，在肿瘤的形成中发挥着重要作用[6]。在乳腺癌组织中检测到Wip1－p38 MAPK－p53信号通路的存在，并且肿瘤组织中高表达的Wip1通过Wip1－p38 MAPK－p53信号通路而使内环境失调[20]。Takekawa等[24]提出 p53诱导的蛋白激酶Wip1调控着细胞在UV照射后Wip1－p38 MAPK－p53信号通路的负反馈。

表1 Wip1－p38 MAPK－p53通路蛋白的表达水平Table 1.Expression levels of Wip1－p38 MAPK－p53 proteins(±s.n=12)

表1 Wip1－p38 MAPK－p53通路蛋白的表达水平Table 1.Expression levels of Wip1－p38 MAPK－p53 proteins(±s.n=12)

*P ＜0.05 vs HBE cells.

Group HBE cells NCI－1299 cells A549 cells H460cells p53 1.00 ±0.13 1.10 ±0.20 1.17 ±0.16 1.17 ±0.17 p38 1.00 ±0.06 0.94 ±0.09 0.98 ±0.02 0.94 ±0.11 p－p53 1.01 ±0.01 0.82 ±0.02* 0.79 ±0.25* 0.81 ±0.02*p－p38 0.99 ±0.05 0.74 ±0.07* 0.77 ±0.05* 0.78 ±0.05*Wip－1 0.70 ±0.05 0.96 ±0.02* 0.92 ±0.03* 1.05 ±0.11*

本实验中 Western blotting检测了 p53、p－p53(Ser46)、p38 MAPK和p－p38 MAPK(Thr180/Tyr182)在肺癌细胞和正常支气管上皮细胞中的表达，在正常细胞中p53和p38 MAPK是通过磷酸化活化，进而在各个生物效应中起作用的。我们的实验结果显示:在培养的肺癌细胞和正常支气管上皮细胞中，总的p53和p38 MAPK表达没有显著差异，然而在肺癌细胞中活化的p－p38 MAPK和p－p53表达降低，这引起了细胞的一系列生物效应功能的紊乱，可能导致了肿瘤的发生，而且在肺癌细胞中均有Wip1表达增加，肺癌细胞中存在着Wip1－p38 MAPK－p53信号通路的失衡，提示这一信号通路可能是Wip1在肺癌细胞中致癌的一条途径。既然这条通路在肺癌的形成中发挥了作用，那对于这条通路采取干预措施后是否会对肺癌细胞的增殖和凋亡产生影响呢?针对恶性肿瘤中p38 MAPK信号通路靶向治疗的研究已经开始，Wip1对磷酸化的p38 MAPK的去磷酸化活性可以被ATO阻滞，也证实了在急性早幼粒细胞性白血病细胞中应用ATO后出现了p38 MAPK的磷酸化诱导活化。更重要的是，这种ATO所引导的p38 MAPK/p53凋亡活化途径可以通过siRNA技术抑制Wip1的表达而增强[21]。既然肺癌细胞中存在着Wip1－p38 MAPK－p53信号通路的失衡，是否ATO在肺癌中也能起到相同的作用呢?是否有更有效的药物以Wip1－p38 MAPK－p53信号通路为靶的靶向治疗呢?因此，Wip1这个新的原癌基因在肺癌的治疗方面给我们带来了新的思路。

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