MMP-9、TIMP-1和VEGF在兔颈动脉斑块中的表达及其与新生血管的关系

赵华栋 范学军 伍 明 樊建华 周 平 (中南大学湘雅三医院神经内科，湖南 长沙 4003)

基质金属蛋白酶(MMPs)是一组能降解细胞外基质的锌依赖性蛋白酶，在动脉粥样硬化形成及斑块的不稳定性改变中，能起着主要的作用。目前基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)与颈动脉粥样硬化斑块特别是早期斑块内新生血管的关系尚不肯定。本研究旨在通过检测早期斑块形成过程中MMP-9、TIMP-1及血管内皮生长因子(VEGF)表达水平，结合超声造影检查，以探讨其在早期斑块内新生血管形成中的作用及对斑块稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康雄性新西兰大白兔40只，由中南大学湘雅医学院动物实验中心提供，随机分为4组，每组10只，空白对照组(A组)、高脂饮食组(B组)、硅橡胶圈干预联合高脂饮食14及28 d组(C组、D组)，所有动物经适应性喂养1 w后用于实验。

1.2 硅橡胶圈制作 参考刘恒方等〔1〕的方法，结合本实验目的，硅橡胶圈采用液体医用硅胶在模具(由中国机械工业第六研究设计院提供)中塑型为标准制作。

1.3 制作动脉粥样硬化模型及取材 经耳缘静脉缓慢注射3%的戊巴比妥钠液 (30 mg/kg)，麻醉成功后，颈部正中切口，密闭型硅橡胶圈，置入右侧颈动脉外膜。左侧为伪手术组，接受相同操作，在缝合皮下前将硅橡胶圈取出。术后将牵拉的血管和神经放回原位置，硅橡胶圈开口处用硅胶封闭，避免硅胶和颈动脉的外膜接触，术后75%酒精消毒切口处，肌注青霉素4万U/次，2次/d，共计3 d。术后次日给予高脂饲料 (1%胆固醇+6%花生油+99%普通饲料)喂养，共喂养28 d。经超声造影证实颈动脉斑块模型制作成功后 (C组14 d超声造影后，其余三组饲养28 d后)随即过量麻醉处死动物，快速切除放置硅胶管处及对侧相应的颈动脉组织，置入甲醛中固定，标本石蜡包埋，常规HE染色和Masson染色。

1.4 超声造影 造模第14天、第28天行超声以及超声造影检查。超声下观察兔左、右颈动脉斑块形成情况。并以超声下定位清楚的硅橡胶圈段颈动脉斑块为超声造影检查对象，经耳缘静脉快速团注SonoVue造影剂 (上海博莱科信宜药业有限责任公司)，实时观察并储存造影全过程。对比观察并收集各组有颈动脉斑块的白兔的两次数据。造影后通过彩色超声诊断仪自带的声学定量分析软件绘制颈动脉斑块内和颈动脉管腔内的时间-强度曲线 (TIC)，测定其峰值强度 (PI)。

1.5 免疫组织化学检测及结果判定 鼠抗兔MMP-9多克隆抗体、鼠抗兔TIMP-1多克隆抗体及兔抗人VEGF单克隆抗体均购自美国Thermo公司，CD31鼠单克隆抗体购自Abcam公司。石蜡包埋后标本行5 μm厚连续切片，一张行HE染色，一张行Masson染色，余者采用ABC法行免疫组化染色，染色步骤按说明进行。所有切片在尼康80i荧光显微镜下进行观察并采集放大100倍及400倍时图像，颈动脉斑块内MMP-9、TIMP-1、CD31、VEGF阳性表达为细胞内棕褐色或棕黄色、淡黄色颗粒。图像采用Image-Pro Plus 6.0软件测量斑块内阳性细胞积分光密度 (IOD)值及面积并计算MOD值。

1.6 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，对资料进行t检验，两变量间相关性分析采用线性相关分析。

2 结果

2.1 影像学观察 颈动脉超声A组、B组未见斑块形成，第14天C组7只、D组10只兔硅橡胶圈段颈动脉管腔有不同程度狭窄，粥样斑块形成，超声造影显示斑块内有新生血管形成，D组28 d超声造影PI值明显高于14 d(43.09±3.28，P＜0.05)，C、D组14 d的 PI值差异无显著性 (24.37±1.58，23.72±2.09，P＞0.05)。

2.2 组织学观察 C组、D组HE染色示兔右侧硅橡胶圈段颈动脉管壁不光滑，管腔内有斑块形成，内膜增厚，内膜下脂质浸润，平滑肌细胞增生排列紊乱，斑块内有CD31阳性表达标记的新生血管形成。A组和B组未见明显斑块形成。见图1。

2.3 免疫组化分析

2.3.1 MMP-9、TIMP-1的表达 MMP-9、TIMP-1亦是胞质阳性表达，以细胞质内出现明显的黄色或棕黄色颗粒视为阳性着色，在斑块的肩部及巨噬细胞和泡沫细胞聚集区高表达，MMP-9、TIMP-1在A组、B组内膜无明显阳性表达;在C组、D组斑块有阳性表达，且随斑块的进展，MMP表达有所增高，TIMP-1表达减少，但均无统计学差异 (P＞0.05)。见表1，图2。

2.3.2 VEGF的表达 VEGF蛋白是胞浆阳性表达，呈棕黄色，在斑块内部及血管内膜均有着色，A组和B组家兔颈动脉动脉内膜基本上无血管内皮生长因子表达;C组与D组家兔颈动脉斑块及血管内膜层染色血管内皮生长因子均有阳性表达，D组表达明显多于C组 (t=8.546，P＜0.01)。见表1，图 3。

2.3.3 CD31的表达 CD31标记的新生血管内皮细胞阳性染色呈棕黄色或棕褐色。A组、B组颈动脉内膜无CD31表达;C组、D组CAS斑块内有CD31阳性表达标记的新生血管形成，且D组较C组新生血管明显增多 (t=2.647，P＜0.05)。见表1，图4。

2.3.4 相关性分析 在颈动脉早期斑块组织中CD31的表达与MMP-9/TIMP、VEGF呈明显正相关 (P＜0.01);CD31与MMP-9和TIMP-1表达均无明显相关性 (P＞0.05)。

表1 C、D组MMP-9、MMP-9/TIMP-1、VEGF、TIMP-1及CD31蛋白表达水平比较(±s)

表1 C、D组MMP-9、MMP-9/TIMP-1、VEGF、TIMP-1及CD31蛋白表达水平比较(±s)

与C组比较:1)P＜0.01，2)P＜0.05

组别MMP-9 MMP-9/TIMP-1 VEGF TIMP-1 CD31 C组(n=10) 0.391 5±0.127 1 0.598 6±0.110 2 0.224 4±0.031 40.633 7±0.076 1 0.275 5±0.035 8 D组(n=10) 0.420 6±0.236 2 0.894 3±0.291 3 0.316 4±0.046 51) 0.571 2±0.127 9 0.389 1±0.032 32)

图1 各组动脉HE染色结果(×200)

图2 颈动脉斑块MMP-9、TIMP-1免疫组化结果(×200)

图3 C、D两组颈动脉斑块VEGF免疫组化结果(×200)

图4 C、D两组颈动脉斑块CD31免疫组化结果(×400)

3 讨论

临床研究表明，颈动脉粥样硬化易损斑块的形成和发展与斑块内新生血管形成密切相关〔2〕。新生血管可以促进颈动脉粥样硬化病变的发展，甚至诱发斑块内出血和斑块破裂，从而导致急性心脑血管疾病的发生。Moreno等〔3〕研究人类破裂的动脉粥样硬化性斑块中的新生血管数量，发现破裂斑块内的微血管密度明显高于未破裂斑块，得出粥样硬化斑块内新生血管密度和斑块不稳定性呈正相关的结论。

超声造影是常规超声检查的有效补充，除具有可以清晰地显示颈动脉血管壁内中膜(尤其是前壁)厚度，发现常规超声易漏诊的斑块，较清晰显示颈动脉远端及深部病变，精确判断颈动脉狭窄程度或闭塞等优势外〔4～6〕，还可以实时追踪并显示斑块内新生微小血管，根据增强情况对斑块的易损性进行可视化定量评估。近年来国内外研究表明，超声造影对颈动脉斑块内新生血管的监测具有较高的敏感性，根据其增强情况对斑块内新生血管的密度进行定量研究，从而评估斑块的易损性。Shah等〔7〕对颈动脉内膜剥脱术的患者分别行斑块超声造影及病理组织学CD31、CD34免疫组化分析，证实了颈动脉斑块内新生血管形成的造影增强超声成像与手术标本的半定量组织学评分之间具有很好的相关性。

在斑块新生血管形成过程中，MMPs起着重要作用，MMPs通过降解基底膜和重塑细胞外基质(ECM)使内皮细胞从原有血管迁移到外周形成新生血管〔8〕。MMP-9是MMP家族中重要的一员，可以降解Ⅳ型胶原和明胶，调节细胞间的黏附，客观上有利于新生血管形成，TIMP-1是MMP-9的天然抑制剂，可与其1∶1结合而抑制其活性。研究表明，在肿瘤新生血管中，单纯的MMPs升高并不一定导致新生血管形成，只有在MMPs与其抑制剂不平衡时才导致基质降解的不适当增加从而导致肿瘤组织新生血管形成增多〔9〕。本研究证实在颈动脉早期斑块中新生血管形成与MMP-9/TIMP-1呈正相关，说明MMP/TIMP比例失调是导致颈动脉斑块内新生血管形成的主要原因之一。

VEGF是促血管新生的重要因子，通过与血管内皮细胞的特异受体结合，发挥强大的促内皮细胞增殖、促血管生成作用〔10〕。研究表明，VEGF与MMPs具有相互促进作用。MMPs可以降解血管基膜及细胞外基质，调节细胞黏附，在新生血管形成中发挥重要作用;而VEGF则能特异性地促进内皮细胞增殖，提高血管通透性，促进细胞外基质降解;同时，TIMPs通过抑制MMPs的活性，抑制血管生成素诱导的血管内皮细胞出芽生长等，防止ECM降解，维持血管的稳定性，它们相互影响，共同参与斑块内新生血管的发生、发展〔11〕。在本研究中，D组斑块内VEGF表达较C组明显增多，即随着时间的延长斑块内新生血管增多且与斑块中MMP-9/TIMP-1呈正相关。

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3 Moreno PR，Purushothaman KR，Sirol M，et al.Neovascularization in human atherosclerosis〔J〕.Circulation，2006;113(12):2245-52.

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8 Joseph DR，Raouf AK.Matrix metalloproteinases and their inhibitors in vascular remodeling and vascular disease〔J〕.Biochem Pharmacol，2008;75(6):346-59.

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11 夏玉芳，娄艳辉，于云鹏，等.MMP-2、TIMP-2及VEGF蛋白在子宫内膜异位症裸鼠模型组织中的表达及意义〔J〕.青岛大学医学院学报，2007;4(13):313-5.