磁流体热疗对体外人肺癌细胞A549的影响

2011-09-11 04:47王国卿李浒胡润磊柯贤福魏东山孟文
中国肺癌杂志 2011年3期
关键词:磁流体热疗细胞周期

王国卿 李浒 胡润磊 柯贤福 魏东山 孟文

肺癌是严重危害人类生命健康的常见疾病,发病率高,预后较差。传统的手术、化疗以及放疗可使部分患者受益。但是大部分患者在确诊时多失去手术机会[1]。因此,临床上迫切需要采取另一种有效的办法来治疗肺癌。

肿瘤热疗(或称加温治疗)是近年来发展较快的一种治疗方法,传统的热疗方法均有靶向性差的特点,常导致周围正常组织损伤,因此应用比较局限。磁流体热疗(magnetic fluid hyperthernia, MFH)是将纳米技术和热疗相结合的一种新兴热疗方法。Jordan等[2]率先开展了此方面的研究。将纳米级的磁流体直接注射到肿瘤内部,在交变磁场的作用下磁流体通过Neel机制升温至有效的温度[3],从而杀死肿瘤细胞,而周围正常组织没有磁流体的分布,不升温或升温不明显,因此具有高度的靶向性和特异性。

近年来,国内外学者在此方面做了部分研究工作,研究主要集中在实验研究阶段,涉及到的肿瘤主要有黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、神经胶质瘤等[4-7]。研究证实,磁流体热疗可以抑制肿瘤的生长,延长生存期,但是涉及到人肺癌的研究未见报道。为此,本研究从体外研究Fe3O4磁流体在交变磁场下对人肺癌细胞A549的作用及其作用机制,从而为体内抗肿瘤实验提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要试剂 MTT、DMSO、胰蛋白酶、RPMI-1640均由Sigma公司提供。

1.1.2 细胞株 人肺癌细胞株A549由杭州昊天生物有限公司提供,用含10%胎牛血清RPMI-1640培养液。

1.1.3 磁流体 纳米级Fe3O4颗粒,采用化学共沉淀法制成胶体混悬液,呈黑色。样品粒径范围为10 nm-40 nm,磁饱和强度是360 GS。样品使用前均以超声波处理5 min,使Fe3O4颗粒分布更均匀(图1)。

1.1.4 主要仪器设备 高频感应加热机(型号:SP-04AC 4 KW):深圳市双平电源技术有限公司提供,频率为100 KHz-250 KHz,感应线圈,由4匝直径为4 mm的铜管平行绕成内径为3 cm、长为4 cm的线圈,铜管内通循环水。流式细胞仪(型号EPICS XL型):美国Coulter公司产品。透射电镜(JEM-1230型透射):日本JEOL公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞计数法观察各组人肺癌细胞的生长曲线 将1×105/mL的细胞悬液接种于10 cm2培养瓶中,按分组A、B、C、D、E顺序加入含有不同浓度磁流体的培养液,使终浓度分别为0 mg/mL、1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、4.5 mg/mL、6.0 mg/mL,每瓶3 mL,每个时间点设置3瓶,交变磁场作用30 min,参照文献[8]绘制生长曲线。

1.2.2 MTT法观察人肺癌活细胞的光密度值及杀伤率 取对数生长的人肺癌细胞A549,将细胞调成1×105/mL的浓度,设置对照组(A组)和实验组,实验组按B、C、D、E顺序加入含Fe3O4磁性纳米粒的RPMI-1640培养液,每瓶3 mL,使各组终浓度分别为1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、4.5 mg/mL、6.0 mg/mL,以没有加磁流体的RPMI-1640培养液作为A组,交变磁场作用30 min,参照文献[9]行MTT实验。用酶标仪590 nm处测量光密度值(optical density, OD),取均值,计算细胞生长抑制率[即杀伤率(cytotoxity index, CI)]=(1-OD处理/OD对照)×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测各组肺癌细胞的细胞周期及凋亡率继续将上述5组含Fe3O4磁性纳米粒的培养液调成终浓度为1.5 mg/mL、3.0 mg/mL、4.5 mg/mL和6.0 mg/mL,每瓶3 mL,每组均为3瓶,磁场作用30 min,培养24 h,胰酶脱壁,制成单细胞悬液,75%乙醇后固定后置4oC冰箱中过夜,用Rnase A(终浓度为20 μg/mL)消化RNA,37oC孵育30 min,流式细胞仪检查各组肺癌细胞的凋亡率和细胞周期的变化。

1.2.4 光学及电子显微镜观察细胞形态 上述5组细胞磁场作用30 min后,继续培养24 h,0.25%胰酶脱壁,加入RPMI-1640 1 mL制成单细胞悬液,细胞贴壁生长24 h,继续培养48 h,光学显微镜下观察细胞形态的变化。然后用0.25%胰酶消化细胞,800 rpm离心5 min、PBS(pH7.4)洗2次、4%预冷戊二醛4oC固定过夜,1%的锇酸溶液固定样品1 h-2 h,将经过渗透处理的样品包埋起来,70oC加热过夜,在Reichert超薄切片机中切成70 nm-90 nm的薄片,用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色15 min,透射电镜观察。

1.3 统计学处理 利用SPSS 13.0软件包进行方差分析,数据用Mean±SD表示,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组温度的变化 随着磁流体中Fe3O4浓度的增加,升温越快,峰值温度越高,B组峰值温度为40.1oC,C组的峰值温度为42.5oC,D组的峰值温度为45.1oC,E组峰值温度为49.1oC。

2.2 人肺癌细胞A549的生长曲线 随着时间的延长,A组肺癌细胞数逐渐增加。12 h内B组和C组细胞增长受到轻度抑制,但培养24 h后肺癌细胞计数逐渐增加;对于D组和E组,随着时间的延长,肺癌细胞增殖受到明显抑制。加温后24 h,A组的细胞计数为(17.9±0.3)×104/mL,D组的细胞计数为(5.4±0.1)×104/mL,E组的细胞计数为(1.3±0.1)×104/mL,与对照组比较,均有明显差异(P<0.01);加温后48 h,对照组细胞计数为(46.1±0.9)×104/mL,D组的细胞计数为(5.9±0.4)×104/mL,与对照组比较,均有明显差异(P<0.01),而加温后48 h E组的细胞全部死亡。具体细胞生长曲线见图2。

2.3 各组人肺癌细胞A549的光密度值及杀伤率 随着磁流体浓度的增加,5个组OD值逐渐变小,CI值逐渐增大,杀伤率增加。A组的OD值为0.17±0.01,B组OD值为0.17±0.01,C组OD值为0.15±0.02,D组OD值为0.07±0.02,E组OD值为0.05±0.02。

2.4 流式细胞仪检测人肺癌细胞A549的凋亡率及细胞周期 流式细胞术检测A组、B组、C组、D组、E组人肺癌细胞A549的凋亡率分别为(2.41±0.20)%、(6.30±0.80)%、(14.22±1.60)%、(27.06±1.20)%和(49.53±3.10)% ,与A组比较,有明显差异(F=413.243,P<0.001)(图3)。流式细胞术检测A组、B组、C组、D组、E组人肺癌细胞A549的细胞周期提示,人肺癌细胞A549细胞G1期细胞随着Fe3O4浓度的增加呈现明显减少趋势,S期和G2期细胞呈现逐渐增加的趋势;D组与E组的细胞周期间无明显差异(P>0.05)(表1)。

图1 磁流体粒子的电镜照片。照片显示粒子直径在10 nm-40 nm之间(×200万)Fig 1 SEM images of magnetic fluid particle. The picture showed that the diameter of the particle was about 10 nm-40 nm (×2,000,000).

图2 各组人肺癌细胞A549生长曲线比T较imeFig 2 The growth curve of cells in different groups

图3 磁流体热疗后各组人肺癌细胞凋亡和周期图Fig 3 The apoptosis of A549 cells were observed and the cells were arrested at the stage S

2.5 光学及电子显微镜观察细胞形态 倒置光学显微镜下观察各组细胞形态变化,A组和B组(40.1oC)细胞大小基本一致,无细胞破裂,细胞数较多,生长旺盛。C组、D组、E组随着磁流体浓度的升高,正常细胞数逐渐减少,坏死细胞及细胞碎片逐渐增多(图4)。通过电镜观察发现,热疗后细胞染色质浓集、胞浆空泡化、细胞核裂解,其中由于温度达到49.1oC,E组细胞核呈现溶解,正常细胞结构消失,呈坏死表现(图5)。

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率已居所有癌症之首[10],由于早期肺癌没有明显的临床症状,大部分病例发现时均属晚期,手术效果差。传统的放化疗由于毒副作用大且价格昂贵,多数患者不能耐受;传统的热疗方法如射频、微波、超声等均有加温的特异性差、不能针对某一特定靶区加温的缺陷,大大降低了热疗的效果。因此探索一种治疗效果好、副作用小的热疗方法成为广大从事肺癌研究学者的目标。

表1 各组人肺癌细胞A549细胞周期变化Tab 1 Comparison of cell cycles of A549 cells among different groups

图4 磁流体热疗后各组人肺癌细胞的光镜下形态学改变(×400)。A(Control组)和B(Fe3O4 1.5 mg/mL组):细胞生长形态基本差别不大,呈梭形,分布规则,胞核清晰突出;C:Fe3O4 3.0 mg/mL组,细胞开始出现死亡;D:Fe3O4 4.5 mg/mL组,随着温度升高,死亡的细胞越多;E:Fe3O4 6.0 mg/mL组,细胞全部死亡。Fig 4 Changes in cell morphology were observe by light microscopy (×400). A (Control group) and B (Fe3O4 1.5 mg/mL group): The human being carcinoma A549 cells have no evident changes; C (Fe3O4 3.0 mg/mL group)and D (Fe3O4 4.5 mg/mL group): Most of the human being carcinoma A549 cells were observed to have cell death, karyopyknosis by light microscopy; E (Fe3O4 6.0 mg/mL group): All cells were observed to have cell death.

磁流体热疗的优点主要是其高度的靶向性和特异性[11],因此它是一种非常有前途的肿瘤治疗方法。在体外,我们探讨了不同温度条件下磁流体热疗对人肺癌细胞的影响。结果发现,磁流体的温度与其浓度呈量效关系,浓度大,峰值温度高,对肺癌细胞的增殖抑制作用越明显。研究发现,4个实验组中,最低浓度B组(1.5 mg/mL)峰值温度为40.1oC,未达到热疗的有效范围温度[11],对肺癌细胞的增殖无明显抑制,而C、D、E三组的温度均达到了有效热疗温度,细胞的生长受到抑制。其中最高浓度的E组(6.0 mg/mL)峰值温度为49.1oC,人肺癌细胞的生长受到明显的抑制,48 h后细胞几乎全部死亡。这说明可以通过控制磁流体的剂量来实现热疗的控温[12],从而选择有效的温度来杀死肿瘤细胞,达到治疗的目的。

研究证实,热疗可以通过直接物理作用造成正常细胞和肿瘤细胞的凋亡和坏死[13],且温度越高,凋亡越明显[14]。凋亡是一种细胞主动自杀的过程,是细胞死亡的一种特定形式,凋亡有其自身的特征性改变,包括形成DNA碎片、染色质边集、胞浆空泡化、细胞皱缩以及形成凋亡小体等[15,16],研究[17]发现,肿瘤细胞在42.0oC的条件下就可以凋亡。我们的实验结果发现,浓度≥3.0 mg/mL时,峰值温度≥42.5oC,细胞增殖开始受到抑制,温度越高,抑制越明显。电镜下可见明显的凋亡改变。流式细胞术检测发现,随着温度的增高,凋亡率越高。其中E组(6.0 mg/mL, 49.1oC)的肺癌细胞48 h后几乎全部凋亡、坏死,说明温度越高凋亡越明显,治疗效果越好。

图5 磁流体热疗后各肺癌细胞电镜观察图(×8,000)。A(Control组):正常A549肺癌细胞的电镜下表现;B(Fe3O4 1.5 mg/mL组):肺癌细胞热疗后电镜观察无明显改变;C(Fe3O4 3.0 mg/mL组):肺癌细胞热疗呈凋亡样改变,表现为染色体边聚;D(Fe3O4 4.5 mg/mL组):肺癌细胞热疗后表现为核碎裂,也是凋亡的一种形态学表现;E(Fe3O4 6.0 mg/mL组):在49.1 oC较高温度条件下表现为坏死样改变,细胞正常形态消失,核溶解,大量细胞碎片形成。Fig 5 Changes in cell morphology were observed by electron microscopy (×8,000). A (Control group): Normal human being carcinoma A549 cell; B (Fe3O4 1.5 mg/mL group): A549 cells does not have apparent change; C (Fe3O4 3.0 mg/mL group): A549 cells were observed to have margination;D (Fe3O4 4.5 mg/mL group): A549 cells were observed to have a form of nuclear fragmentation in apoptosis by electron microscopy; E (Fe3O4 6.0 mg/mL group): Necrosis were observed at 49.1 oC.

真核细胞周期分为有丝分裂期和间期,细胞的生长、分裂依次经过G1期、S期、G2期、M期,至于热疗后对细胞周期各期的阻滞均有报道[18-22],我们用流式细胞仪测定热疗后人肺癌A549细胞周期的变化,结果表明磁流体热疗后细胞周期发生了明显的改变,G1期细胞减少,S期和G2期细胞增多。说明磁流体热疗后人肺癌A549细胞出现S期阻滞。S期是细胞周期进程中一个十分重要的阶段,此阶段主要是大量的DNA复制过程,同时也合成组蛋白和非组蛋白,最后完成染色体的复制。因此S期的阻滞对DNA的复制产生了巨大的影响,进而导致细胞凋亡。

尽管学者们对热疗治疗肿瘤的机理做了大量的研究,其中诱导凋亡、导致坏死、阻滞细胞周期是目前大家比较认可的机制之一,但确切的机制尚无定论,磁流体热疗的确切机制同样有待于进一步研究。本实验通过不同浓度的Fe3O4磁流体在交变磁场作用下在体外对肺癌细胞的影响的研究,初步证实磁流体热疗可以明显抑制人肺癌A549细胞的增殖,诱导其凋亡、导致坏死、阻滞细胞于S期,是磁流体热疗对人肺癌研究的一个切入点,其结果必将为磁流体热疗在肺癌领域的进一步研究打下良好的基础。

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