小新月菱形藻固定化培养初步研究

陈书秀 王虎

（1 山东东方海洋集团有限公司 山东烟台 264003 2 烟台海融生物技术有限公司 山东烟台 265600）

小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)俗称“小硅藻”，是我国较早培养和应用的单胞藻饵料，其个体小，繁殖快，脂肪含量高，环境适应能力强，可作为理想的保健食品，在海水养殖业中占有重要地位。目前小新月菱形藻主要采用继代法来进行保存，该方法由于数次接种容易导致藻种污染或者藻种的遗传漂变，近几年固定化藻类的研究正在迅速发展，在能源生产、污水处理和种质保存等领域有很大的应用前景，尤其是在保重和次级代谢产物的生产方面，引人瞩目[1]。本文研究了固定化条件对小新月菱形藻生长的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料：小新月菱形藻(Nitzschia closterium f.minutissima)

1.2 试验步骤：

1.2.1 载体的制备：称取海藻酸钠3g，在开水浴中慢慢搅动(约1h)溶人100 mL蒸馏水中，配成3%(W/V)的凝胶溶液，加人2gNaC1，煮沸消毒备用。以凝胶溶液与鲜藻体积比为4：1的比例接种藻种，充分搅匀后制成胶～藻混悬液，用注射器吸取混悬液，滴入CaC12溶液中，约30min后形成固化的海藻酸钙胶珠。用消毒海水洗涤3遍后，按各试验的要求培养于100mL的三角烧瓶(50mLf/2培养液)中。

1.2.2 实验设计

1.2.2.1 胶珠直径试验：在实验室无菌条件下，将藻细胞与3%海藻酸钠以体积比1:4混合，在2%CaC12溶液中用不同型号的注射器针头4.5#、6#、7#分别制备不同直径的胶珠。藻接种密度为1.74×105cells/mL，胶珠粒数为200粒，培养液体积为50mL。每组设3个平行。

1.2.2.2 接种密度试验：在实验室无菌条件下，分别将不同密度的藻细胞与海藻酸钠混合，在2%CaC12溶液中利用6#针头制备成胶珠，粒数为200个，培养液体积为50mL。最终密度为1.75×103、1.75×104、1.75×105、1.75×106，每组设3个平行进行培养。实验开始后每隔4d测定其细胞密度。并在此期间定期观察了各组间的差异。

1.2.2.3 CaCl2浓度试验 分别配制1%、2%、3%、4%CaC12溶液，灭菌备用。在无菌条件下，将一定密度的微藻藻液与海藻酸钠混合（体积比为1:4），用6#注射器针头，分别滴入不同浓度的CaC12溶液中形成胶珠，胶珠个数为200个，用消毒海水洗涤3遍后，培养于100mL的三角烧瓶(50mL培养液)中，每组设3个平行。

1.2.2.4 胶珠密度试验：胶珠密度定义为相同的藻初始接种总密度，相同培养液(体积l00mL)中，三角瓶中胶珠的数量。将海藻酸钠一微藻混合液用6#针头滴于2%的CaC12溶液制备成胶珠，分别设有数量为100、200粒、300粒的固定化组，每组设3个平行进行培养。

2 结果与讨论

固定化小新月菱形藻培养4天后在小球内形成气泡，部分胶球上浮，8天左右小球颜色为褐色，球内形成菌落，小球大部分沉到瓶底。

2.1 胶球直径对固定化细胞生长的影响（见图1）

从图1可以看出，开始时6#针头制作的胶球细胞生长较快，8d后4.5#针头制作的胶球细胞开始迅速增长。可能由于4.5#针头制作的胶珠个体小，若制作相同数量的胶珠，最初单位体积内接种的细胞量相对较少，从而导致了较长的延缓期。但从总的生长趋势来看，针头越小，胶珠直径越小，细胞的生长量越大。胶珠直径越大，所产生的扩散传质阻力越大，胶珠内细胞所需营养不足，积累的代谢产物增多，细胞生长环境恶化，同时胶珠内部的光照不足[2]，所以这些不利条件使得大直径的固定化小新月菱形藻生长受阻，又因胶珠越小，制备速度越慢，一般选用6#针头。24天时更换培养液，藻细胞继续生长。

2.2 接种量对固定化细胞生长的影响（见表1）

从表1可以看出，接种量越大，其生长量越大。但从生长率来看，初始接种量低于104个细胞/mL或高于105个细胞/mL时，生长率较低。所以在对小新月菱形藻进行固定化培养时初始接种量最好控制在104-105个细胞/mL。

2.3 CaCl2浓度对固定化细胞生长的影响

为获得处于固定化状态的微藻，首先应保证固定化胶珠本身具有一定的强度，力粒度和孔隙度等，以防止固定化胶珠散落，同时保证微藻生长过程中底物和代谢物及时进出胶珠，维持微藻处于较好的生长条件[3]。从表2可以初步看出，CaCl2浓度较低时，细胞生长率较高，其中2%的浓度组高于1%的浓度组生长率。

2.4 胶珠密度对固定化细胞生长的影响

从表3可以看出，胶珠密度越小，细胞生长率越高，其中200粒/50mL的实验组稍高于100粒/50mL实验组的生长率。当胶球密度过高时，培养液中的营养盐消耗较快，胶珠之间遮光严重，使得光照不足，从而引起藻细胞衰老和死亡[4]。胶珠密度过低则使其对外界环境的变化比较敏感，细胞易受损伤，生长速率较慢[4]。从本实验结果来看小新月菱形藻固定化培养时的最佳胶珠密度为200粒/50mL。

2.5 固定化培养与自由化培养比较

采用6#针头，2%CaCl2，在含50mL培养液的100mL三角瓶中放置200个胶珠，小新月菱形藻有较好的生长速率，按此条件将小新月菱形藻进行固定化培养，比较游离和固定化的小新月菱形藻的生长情况，如图2表明，游离生长的速率明显高于固定化细胞的生长速率，但固定化的细胞生长周期长。细胞固定化后，生长较缓慢，可能是营养物质和光线进入胶珠收到一定程度的影响所阻碍的缘故[1]，但在实验周期内，一直处于不断的生长阶段，表明固定化小新月菱形藻具有较长的生长周期，有利于进行种质保存。

综上所述，胶粒大小、不同接种量、CaCl2浓度及胶珠密度对小新月菱形藻固定化细胞产生了显著的影响，选择适宜条件可以提高生长速率及生长量。通过对自由化细胞及固定化细胞生长曲线的比较，小新月菱形藻可以采用固定化细胞的方式进行保存，保存时间的长短还需要进一步的实验验证。

[1]张继红，马志珍. 三角褐指藻固定化培养的初步研究[J].海洋水产研究，19（1）：14-17.

[2]李英敏，杨海波，张欣华等. 叉鞭金藻固定化培养的初步研究[J]. 生物学杂志，19（6）：25-27.

[3]李英敏，杨海波，张欣华等. 盐藻固定化培养的初步研究[J]. 生物技术，2001,11（2）47-49.

[4]刑荣莲，苏杭，苏群等. 固定化菱形藻的生长及营养成分变化[J]. 中国水产科学，2010,17（2）：274-280.