HPLC法定量分析水中光合细菌菌体产量

赵 微，张光明

(哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，150090哈尔滨，gmgwen@gmail.com)

光合细菌(Photosynthetic bacteria，PSB)是一类以光作为能源、能在光照厌氧或黑暗好氧条件下利用有机物、硫化物、氨等作为供氢体兼碳源进行光合作用的微生物.PSB能有效处理高浓度有机废水[1]，对淀粉、豆制品加工[2]、啤酒厂[3]、油脂工业等工业废水及生活污水，处理效果好，对COD的去除率达到60% ～95%，且PSB菌体本身含有丰富的营养物质和生理活性物质[4]，能够作为肥料、饲料、饵料[5]回收利用，在处理废水的同时可实现污水资源化.然而，由于废水中各种干扰物质的存在，使得废水中PSB菌体产量的准确测量存在问题.

在纯培养条件下PSB的定量检测方法包括显微镜直接计数法、平板计数法、紫外分光光度法与可见分光光度法、HPLC法等.显微镜直接计数法随机性大，不能宏观、全面地反应菌体数量，在废水处理中一般不采用该方法.平板计数法计数周期长、方法复杂，在废水处理中一般也不采用该方法.紫外分光光度法与可见分光光度法受废水中杂质影响较大，尤其是受色度的影响，因此这2种方法不适合检测带有浊度或色度的废水.HPLC法虽然方法简便易行、精确、不受废水中杂质影响，但不能将PSB作为直接检测物来分析.吴祖芳等的研究[6]表明，PSB 中含有一种特征物质 CoQ10[7](CoQ10又称泛醌，化学名称为2，3－二甲氧基－5－甲基－6－癸异戊烯基－1，4－苯醌).其在PSB中含量较高且相对稳定，可以用它的含量来定量表征PSB的菌体产量.目前CoQ10的检测方法包括紫外分光光度法、可见分光光度法、HPLC法等.同样由于废水中杂质的干扰，导致不能使用分光光度法分析CoQ10的质量.可选的检测方法只有HPLC法，目前测定废水中PSB内CoQ10质量的HPLC方法，国内外未见报道.因此本文研究采用HPLC法分析CoQ10的含量以表征废水中PSB的菌体含量，排除各种干扰因素，拟建立定量分析废水中PSB菌体产量的方法，以期为PSB在废水中的检验与定量分析提供科学依据.

1 试验

1.1 材料

试验所采用的光合细菌为球形红假单胞菌(Rp.sphaeroids)，购于中科院微生物研究所.试验采用活性污泥模拟废水中各杂菌，污泥取至处理生活污水A/O工艺的二沉池.试验废水采用浊度较大，有机物质含量较多的人工配水来模拟大豆废水.试验仪器与药品:冰箱(BCD－216ST，Haier);超声波清洗器(HS3120，BENCHTOPCLEANERS);高效液相色谱(Agilent 1200，Agilent Technologies，Inc.).CoQ10标准品(Sigma 公司生产);甲醇、无水乙醇、乙腈、丙酮均为色谱纯.

1.2 方法

CoQ10标准样品的制备:取 CoQ10标准样品30 mg，加入无水乙醇40 mL，在50℃水浴中震荡溶解.放冷后，转移至100 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度摇匀，作为标准品母液，将母液分别稀释为 3.0、2.5、2.0、1.5、1.0 mg/L.所有样品均经0.45 μm膜过滤待用.

纯培养基中CoQ10的提取方法:取2.5 mL发酵液在11 000 r/min的条件下离心10 min，分离上清和菌体.菌体用去离子水洗至中性，得到菌体细胞待用.CoQ10的提取采用冻融辅助超声法[8]，将菌体细胞放入冰箱冷冻区冷冻24 h后提取溶剂.样品均经0.45 μm膜过滤后取上清液进行HPLC分析.杂质中CoQ10的提取方法为:分别取7 200 mg/L的大豆废水、160 mg/L的 PSB、7 200 mg/L的大豆废水加 160 mg/L的 PSB，CoQ10的提取方法同上.杂菌中CoQ10的提取方法:取2.5 mL质量浓度为10 000 mg/L的活性污泥，在11 000 r/min的条件下离心10 min，分离上清和菌体.菌体用去离子水洗至中性，得到菌体细胞，CoQ10的提取方法同上.不同培养条件CoQ10的提取方法:将PSB在纯培养基中纯培养7 d，光照－溶解氧条件分别为光照－厌氧、黑暗－好氧、自然光－微好氧.分别取不同培养条件的发酵液2.5 mL，CoQ10的提取方法同上.不同生长时期CoQ10的提取方法:将PSB在纯培养基中培养，光照－溶解氧条件为自然光－微好氧.分别在第24、48、72、96 h 取发酵液 2.5 mL，CoQ10的提取方法同上.安静等研究[9]表明PSB生长前36 h为延滞期，36～72 h为生长期，从72 h开始进入稳定期，96 h以后细胞进入衰亡期.加样回收率试验方法:采用外标加样回收法，取已知含量的CoQ10样品5份，精密称定，分别置具塞的锥形瓶中，加同量的废水 (7 200 mg/L)、PSB(160 mg/L)，CoQ10的提取方法同上.

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

流动相的选择:选用的色谱柱为Sphherisorb C18(10 cm×4.6 mm ID)柱，柱温35℃，紫外检测波长275 nm，进样量15 μL.流动相分别为甲醇和水、甲醇和乙腈、无水乙醇和水、甲醇和无水乙醇.当流动相为甲醇和水时，检测不到CoQ10标准品.当流动相为甲醇和乙腈时，两者任意比例关系下，色谱峰或者不出峰，或者峰型不对称.当流动相为无水乙醇和水时，由于无水乙醇粘度大，CoQ10标准品的保留时间长，柱压特别高.当流动相为甲醇和无水乙醇时，色谱峰峰型对称出峰较好，因此对甲醇与无水乙醇的比例进行深入研究.分别配制甲醇与无水乙醇的体积比为1∶1、3∶2、4∶1、9∶1进行实验，随着流动相甲醇比例的增加CoQ10标准品的保留时间缩短，当甲醇和无水乙醇比例为3∶2时，在28.773 min出峰，当两者比例为4∶1时，在23.257 min处出峰，当两者比例为9∶1时，在21.183 min处出峰.综合比较后发现，不同比例甲醇与无水乙醇为流动相时峰型都很好，出峰时间选择甲醇与无水乙醇的比例为9∶1.

流速的选择:当流速为0.6 mL/min时，CoQ10标准品的保留时间超过35 min，保留时间过长.当流速为 1.5 mL/min时，柱压过高.当流速为1 mL/min时，CoQ10标准品的保留时间21.183 min，柱压16.4 MPa.综合比较，选择流速为1 mL/min.

综合上述结果，本文提出的色谱条件:色谱柱为 SphherisorbC18(10 cm×4.6 mm ID)柱;甲醇与无水乙醇(体积比9∶1)为流动相;流速为1 mL/min;柱温为 35℃;紫外检测波长为275 nm;进样量为 15 μL;柱压为 16.4 MPa.在此条件下，色谱出峰快、峰型良好.采用如上确立的HPLC检测方法，获得CoQ10标准品谱图与标准曲线分别见图1与图2，由图可见，CoQ10标准品的保留时间为21.183 min，CoQ10标准品密度与峰面积具有良好的相关性.

图1 CoQ10标准品HPLC色谱图

2.2 提取溶剂的选择

图2 CoQ10标准曲线

由于CoQ10为细胞内物质，其提取效果的好坏直接关系到产品的收率，许芳等研究表明采用乙醇与丙酮对PSB中CoQ10提取效果较好.本文对菌体细胞分别采用:1)无水乙醇提取5 h;2)丙酮提取5 h;3)丙酮提取5 h后，挥发去除全部丙酮，用无水乙醇溶解.不同提取溶剂对CoQ10提取率的影响见图3，可见，先用丙酮提取5 h后，挥发掉全部丙酮，再用无水乙醇溶解，这一提取方法相对提取率最高.

图3 不同溶剂对CoQ10提取率的影响

2.3 外标加样回收率及检测限实验

采用上述确立的检测方法及提取方法，并进行外标加样实验，加样回收率见表1.平均回收率为99.13%，相对标准偏差为0.81%(n=5).实验表明，上述方法精密度高，重复性好，可用于CoQ10的提取与检测.

表1 加样回收率(n=5)

表2样品中CoQ10质量检测限试验可见，当CoQ10质量浓度低于9.6 mg/L时，检测结果出现很大的偏差，当CoQ10质量浓度高于22.4 mg/L时，由于质量浓度过高也出现很大的偏差，可重复性差，因此对 CoQ10质量浓度的检测限为9.6～22.4 mg/L.当CoQ10质量浓度低于3.2 mg/L时，应先浓缩再进行检测，当 CoQ10质量浓度高于22.4 mg/L时，应先稀释再进行检测.

2.4 不同培养条件与培养时期对PSB内CoQ10质量的影响

PSB内CoQ10的含量是否稳定将直接关系到检测方法的可行性.PSB培养条件光照－溶解氧组合的不同可能导致PSB代谢类型不同，不同代谢类型的PSB内 CoQ10的质量可能不同[10].同一种微生物在不同的生长时期，由于细胞代谢活力、对不良条件的抵御能力、菌体体积的不同可能引起CoQ10含量不同.不同培养条件及培养时期PSB内CoQ10质量的研究见图4和图5.

表2 检测限试验

图4 不同培养条件每克烘干后PSB内CoQ10的质量

由图4可见，黑暗－好氧、光照－厌氧、自然光－微好氧条件下，每克烘干后PSB内CoQ10的质量分别为(41.2±1.7)、(41.6±1.3)、(41.3±2.3)mg，不同培养条件下每克烘干后的PSB内CoQ10的质量稳定.

图5 不同培养时期每克烘干后PSB内CoQ10的质量

由图5可见，在不同培养时期迟缓期、稳定期、对数期、衰亡期每克烘干后PSB内CoQ10的质量分别为(39.8±1.4)、(41.4±2.0)、(40.3±1.8)、(40.1±1.9)mg.不同培养时期每克烘干后PSB内CoQ10的质量稳定.

2.5 废水中干扰因素对PSB内CoQ10质量的影响

废水中的糖类、蛋白质、脂类等杂质的存在可能干扰CoQ10的检测.处理污水过程中不可避免地会感染杂菌，杂菌的菌群中可能含有PSB，因此杂菌的存在也可能干扰CoQ10的检测.废水中干扰因素的研究见图6和图7.

图6 发酵液、大豆废水、发酵液+大豆废水中每克烘干后PSB内CoQ10的质量

由图6可见，发酵液、大豆废水、发酵液+大豆废水中每克烘干后PSB内CoQ10的质量分别为(41.5 ±1.5)、0、(40.3 ±1.9)mg.废水本身不含有PSB，废水中杂质的存在不干扰CoQ10的检测.

图7 发酵液、杂菌、发酵液+杂菌中每克烘干后PSB内CoQ10的质量

由图7可见，发酵液、杂菌、发酵液+杂菌中每克烘干后PSB内CoQ10的质量分别为(41.5±2.1)、(61.2 ± 0.01)、(41.0 ±1.7)mg.杂菌中CoQ10的含量十分的少，与废水中PSB内CoQ10的质量不在同一数量级上，因此杂菌的存在不干扰CoQ10的检测.

由图4～7可见，不同培养条件及培养时期的PSB内CoQ10质量分数非常稳定，废水中的杂质以及杂菌等干扰因素均不影响CoQ10的检测.表明本方法可用于水及废水中CoQ10质量的检测，从而可用于分析水及废水中PSB的产量.

2.6 PSB菌体产量的换算

由图1可知，CoQ10质量浓度与峰面积关系为

由图 4和图 5可知，CoQ10质量分数为4.08%.

由式(1)、(2)可得，峰面积与PSB质量浓度的关系为

其中:X为CoQ10的质量浓度，g/L;Y为峰面积，V·s;R2=0.984 8).

CoQ10质量分数为

3 结论

1)利用HPLC法分析水与废水中CoQ10的质量来定量表征PSB的产量，建立了一个定量表征水及废水中PSB含量的方法.提出色谱条件为:色谱柱为 SphherisorbC18(10 cm×4.6 mm ID)柱;甲醇与无水乙醇为流动相，体积比9∶1;流速为1 mL/min;柱温35℃;紫外检测波长275 nm;进样量 15 μL;柱压 16.4 MPa.

2)先用丙酮提取5 h后挥掉全部丙酮再用无水乙醇溶解这一提取方法对CoQ10的相对提取率最高.平均回收率为99.13%，相对标准偏差为0.81%(n=5).不同培养条件及培养时期PSB内CoQ10的含量十分稳定.废水中杂质、杂菌等干扰因素均不影响检测结果.

3)PSB质量浓度为(Y+37.487)/25.431 g/L，其中Y为峰面积，V·s，可用上述方法定量分析水中PSB的菌体产量.

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