RRLC(高分离度快速液相色谱)法测定孕钙片中叶酸的含量

刘 杰 季晓娟 葛 亮 田树革＊

1．新疆医科大学附属中医医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830002;2．新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830011;3．新疆医科大学中医学院，新疆 乌鲁木齐 830011

叶酸又称蝶酰谷氨酸 (PGA)［1]，是人和动物为维持正常的生理功能而必需从食物中获得供给的微量有机物质。叶酸缺乏可致孕妇妊高征、先兆子痫、胎盘早剥的发生率增高;胎盘发育不良导致自发性流产;其中影响最大的是引起胎儿神经管畸形 (NTD)［2]。近年来，我国已在婴幼儿、老年食品中强化叶酸、乳粉中添加叶酸。因此，建立简单、快速、准确的测定各种食物尤其是婴幼儿、孕妇强化食品中的叶酸含量的方法有重要现实意义［3]。目前常用的检测叶酸方法有：比色法、薄层层析法、微生物法、酶联免疫法和高效液相色谱法［4－7]。孕钙片是以碳酸钙、葡萄糖酸锌、叶酸、维生素类成分等为主要原料制成的保健食品，具有补充钙、锌及叶酸的保健功能，我们采用RRLC(高分离度快速液相色谱)仪对孕钙片中的叶酸含量进行测定，确定测定叶酸含量及控制的有效方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器

RRLC(高分离度快速液相色谱)仪［包括G1322A脱气装置，G1312B二元高压泵，G1367C高性能自动进样器，G1316B柱温箱，G1315C二极管阵列式检测器，色谱柱Zorbax XDB－C18(4.6×50mm，1.8um)];XP205DR电子分析天平 (梅特勒－托利多仪器上海有限公司);KQ－400DB型数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司);TGL－16B离心机 (上海安亭科学仪器厂)。

1.2 样品与试剂

叶酸对照品 (购自中国药品生物制品检定所);乙腈为色谱纯;水为超纯水。其它试剂均为分析纯，孕钙片购自新疆特丰药业股份有限公司，批号为 20091218，20091219，20091220。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为 Zorbax XDB－C18(4.6×50mm，1.8um)，流动相：乙腈－5%甲酸 (31：69)，检测波长：280nm，流速：1.0mL·min－1，柱温：30℃。

2.2 对照品溶液制备

精密称取叶酸对照品适量于50ml容量瓶中，加0.5%氨水溶液溶解，放入超声仪中超声20min，定容，摇匀，制成2ug·mL－1叶酸对照品溶液。

2.3 样品溶液制备

取本品10片，研细，混匀，取约1.0g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入25mL 0.5%氨水溶液，加塞摇匀，放入超声仪中超声20min，使叶酸得到充分提取，取出。加入5mL氯仿，剧烈振摇片刻，静止待分层，取上清液少许于10000r/min离心10min，即得。采用RRLC(高分离度快速液相色谱)仪检测孕钙片中叶酸的含量，其色谱图见图1。1－为叶酸标准品。

图1 叶酸含量色谱图

2.4 线性试验

分别精密量取叶酸对照品溶液1、2、3、4、5 ml置10ml量瓶中，加0.5%氨水定容，进样测定，以峰面积(A)对其浓度 (c)进行线性回归，得线性方程为A=128.12c+23.46，r=0.9996。表明叶酸浓度在0.2－1.0μg·ml－1范围内，有良好的线性关系。

2.5 精密度实验

精密吸取叶酸对照品溶液5uL，连续进样6次，测定叶酸峰面积，其RSD为1.12%。

2.6 稳定性实验

精密吸取孕钙片样品溶液5uL，分别在0，2，4，8，12，24h进样，测定叶酸峰面积，其RSD值为1.56%，表明样品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性实验

精密称取孕钙片粗粉1.0g，共6份，按样品测定法测定，测得叶酸含量平均值为 0.88mg· g－1，RSD为1.32%。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的孕钙片粗粉0.5g，共6份，分别精密加入叶酸对照品0.46mg，以下按样品溶液制备，照上述色谱条件进样测定，其平均回收率为99.28%，RSD为2.65%。结果见表1。

表1 叶酸加样回收率结果

2.9 样品的测定

按“2.3”方法制备样品液，精密吸取叶酸对照品溶液5uL，样品溶液5uL，分别注入高效液相色谱仪，测定色谱峰峰面积，计算其含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 结论

我们采用RRLC(高分离度快速液相色谱)仪测定孕钙片中叶酸的含量，检测结果准确，方法简便。高分离度快速液相色谱仪具有分离速度快、检测灵敏度高等优点，是一种先进的分离检测技术。本实验的相关研究将有助于叶酸类保健品相关产品的分析检测。

［1]汪锦邦，顾鹏，章德宏，等．叶酸分析方法的研究进展［J]．中国食品添加剂，2000，3(6)：49－53．

［2]聂小凤，许榕仙，李健，等．叶酸在妇产科疾病中的研究现状［J]．海峡预防医学杂志，2009，15(1)：27－29．

［3]吕运开，边超，王燕桓，等．固相萃取－离子对液相色谱法测定保健品中的叶酸［J]．食品科学，2009，30(14)：171－174．

［4]刘莉治，罗晓燕，周洪伟，等．高效液相柱后衍生法测定婴幼儿食品中的叶酸［J]．中国卫生检验杂志，2007，17(4)：1179－1180．

［5]刘波，王晓工，王心祥，等．高效液相色谱法测定婴幼儿配方乳粉中叶酸［J]．中国乳品工业，2003，31：39－40．

［6]Dansky LV，Andermann E，Rosenblatt D，et al．Anticonvulsants，folate levels and pregnancy outcome：A prospective study［J]．Ann Neurol，1987，21：76 －82．

［7]Kohashi M ，Inoue K，Sotobayashi H，et al．Microdetermination of folate monoglutamates in serum by liquid chromatography with electroche micaldetection［J]．Chromatogram，1986，382：303－307．