川乌炮制品减毒增效的实验研究

吴刚刚 ,章小菁,梁泽华

(浙江中医药大学,浙江 杭州 100053)

1 引言

川乌为毛茛科植物,乌头的干燥母根,其性味辛 、苦 、热 、有大毒,归心 、肝 、肾 、脾经 。 临床用其炮制品,功能为祛风除湿,温经止痛主要治疗风湿性关节炎,大骨节痛,半身不遂,偏头痛,坐骨神经痛,虚寒性疝气和跌打肿痛等[1]。但在治疗过程中往往因服药过量,导致中毒,临床也常见中毒甚至死亡的事件。川乌主含多种生物碱,其中脂型生物碱毒性最大,主要毒性表现为胸闷,心悸,血压下降(甚至测不出)和各种心律失常,并可导致休克,甚至死亡。本课题组为分析探索出川乌炮制的科学方法,特以毒性中药川乌为基础,通过正确的高效液相和细胞毒性的实验分析方法,验证川乌及其炮制品的毒性,可以为临床诊断乌头碱中毒,抢救乌头碱中毒提供依据,也为毒理学研究川乌毒性提供参考[2]。

2 材料和方法

2.1 实验动物

KM小鼠(18～22)g,雌雄各半,浙江中医药大学动物实验中心提供(卫生使用许可证:SYXKC(浙)2008-0115,动物生产许可证:SCXK(浙)2007-0005)。

2.2 设备

SPS 2001F型电子天平(梅特勒-托利多(常州)称重设备系统有限公司);DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司);SHB-ⅢA型循环水式真空泵(河南省太康科教器材厂);RE52-98型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司);FZ102微型植物试样粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);TD25-WS型自动平衡离心机(赛特湘仪离心机仪器有限公司)。

2.3 药品和试剂

生川乌由长河同春堂药店提供,经浙江中医药大学黄真教授鉴定为毛茛科植物乌头(Aconitum carm ichaeli Debx)的干燥母根。甲醛(分析纯)(批号:20080604,衢州巨化试剂有限公司);无水乙醇(分析纯)(批号:0806073601,安徽安特生物化学有限公司);二甲苯(分析纯)(批号:20080601,国药集团化学试剂有限公司);碘酸钠(批号:20080415,上海锐聪科技发展有限公司)。

2.4 实验方法及原理

2.4.1 川乌炮制品炮制

(1)未炮制品(即生川乌)。直接取川乌洗净,晾晒,切片,干燥,粉碎备用。

(2)米醋法炮制。生川乌洗净,用水浸泡48h,每隔12h换1次水,取出。先将生姜加定量水煮开10min,取汁,然后加米醋,生姜汁(川乌每 50kg,米醋1.25kg,生姜1.25kg)与浸泡后的川乌分别加水共煮90min,取出,晾晒至 6成干,切片,粉碎,备用[3]。

(3)药典法炮制。生川乌洗净,浸泡10～48h,至内无干心,取出,加沸水煮 4～6h,切开无白心,口尝微有麻舌感,取出,切片,粉碎备用[4]。

(4)黑豆法炮制。生川乌洗净,用水浸泡12h,取出,加黑豆,甘草,生姜(川乌每100kg,用甘草5kg,黑豆 10kg,生姜 10kg),加水煮 2h,取出,除去黑豆,甘草,生姜,晾晒至6成干,切片,干燥,粉碎备用[3]。

2.4.2 乌头碱提取

川乌粉加水煎煮2～3次,滤液浓缩至 1∶1～1∶2(mL:g),加适量醇,浓度约为 63%,在25℃下静置(10～48h),滤过;旋转蒸发仪回收乙醇,得乌头碱浸膏。浸膏中生药含量,未炮制组为2.8g/g,醋制组为10.4g/g,药典法为2g/mL。乌头碱能溶于水,醇含量50%～60%时淀粉,多糖沉淀[6]。半数致死量(LD50)是药物、毒物及病原微生物等毒力水平的一个标志。它表示能使全部实验对象死亡半数的剂量或浓度。由于生物间存在个体差异性,因此LD50需用一批相当数量的实验对象进行实验方能测得,并且每种药物不同实验对象的LD50值不相同。测定LD50的方法很多,如目测机率单位法、直线回归法、累计法及序贯法等。由于寇氏法较常用,并有计算简便,结果较准确等特点,故采用该方法进行计算。当最小剂量组的死亡率为0%,最大剂量组的死亡率为100%时,可按下列公式计算[7]LD50:

当最小剂量组的死亡率大于0%而又小于30%,或最大剂量组的死亡率小于100%而又大于70%时,可按下列校正公式计算LD50:

其中SX50为LD50的标准误,Xm为最大剂量组剂量的对数值;i为相邻两组剂量对数之差;Σ p为各组死亡率之和;P为各组死亡率;q为各组存活率;n为各组动物只数;Pm为最大剂量组死亡率;Pn为最小剂量组死亡率。

2.5 毒性实验分析

2.5.1 预试

取昆明小鼠80只,雌雄各半,体重 20±2g,随机分组10组,每组8只。未炮制品和醋制法炮制品分别选择组距较大的一系列剂量,按组1g/kg样品溶液给小鼠灌胃,观察出现的症状。实验结束后采用颈椎脱臼法处死小鼠。

2.5.2 LD50的测定

昆明小鼠80只,雌雄各半,体重 20±2g,随机分10组,每组8只。根据预试结果,生川乌最高剂量组定为9g/kg,最低剂量组定为3g/kg,剂间比为0.76。醋制法炮制品最高剂量组定为118g/kg,最低剂量组定为36g/kg,剂间比为0.74。将样品用蒸馏水配置成所需浓度,以0.2mL/10g小鼠体重给以灌胃。观察统计死亡率,用改良寇式法计算其LD50及其95%可信限。结果见表1。

表1 川乌各炮制品的LD50及95%可信限

从表 1可看出生川乌毒性很强,其 LD50为5.36g/kg,相比其他炮制品的LD50数据可以明显看出,生川乌的致死剂量极低,而川乌经炮制后,毒性明显较生川乌低。出现中毒症状的剂量大大升高,中毒症状也较为减弱。通过实验可以得出黑豆法炮制后,毒性降低最为明显,其次是醋制法和药典法。

2.6 乌头碱药效学实验

2.6.1 热板法镇痛实验

昆明小鼠50只,体重 20±2g,均为雌性,给药前禁食16h,选取痛阈在10～30s内的小鼠,随机分五组,分别为生理盐水对照组、生川乌组、醋制组、药典组、黑豆组,每组10只。每只小鼠按0.1mL/10g(生药0.52g/kg,LD50的1/10)分别给药,空白组给予等体积的生理盐水,药液浓度为0.052g/mL。以生理盐水为空白对照组,测定给药后 30、60、90、120min的痛阈值。实验剂量和结果详见表2。

表2 热板法镇痛实验结果(n=10)

川乌四种不同炮制品对大鼠都具有镇痛作用,与空白组相比均有极显著差异,药典法镇痛效果在一定时间范围内逐渐增强,以90～120min最明显,醋制法的镇痛效果在一定时间范围内逐渐减弱,以30～60min最明显。黑豆法在30min时镇痛效果较佳,随着时间延长略有减弱。前60min的镇痛效果生川乌＞醋制法＞黑豆法＞药典法,90min～120min的镇痛效果是生川乌＞药典法＞醋制法＞黑豆法。黑豆法在前60min时与醋制法相当。

2.6.2 醋酸扭体实验

昆明小鼠50只,雌雄各半,体重 20±2g,给药前禁食16h,随机分5组,分别为生理盐水对照组、生川乌组、醋制组、药典组、黑豆组,每组10只。每只小鼠按0.1mL/10g-1(生药0.52g/kg-1,LD50的1/10)分别给药,空白组给予等体积的生理盐水。以生理盐水为空白对照组,每只小鼠给6%醋酸0.2mL,给药1h,记录15min内扭体次数,并计算不同炮制品对扭体反应抑制率,实验剂量及结果详见表3。

表3 小鼠醋酸扭体法镇痛实验结果 (n=10)

川乌四组不同炮制品对大鼠均具有镇痛作用,其中醋制法、黑豆法与生理盐水组有显著差异,在15min内扭体(腹部收缩内凹,后肢伸展,臀部抬高,蠕动)次数明显减少。其中黑豆法的镇痛效果最为明显,镇痛强度为黑豆法＞醋制法＞药典法＞生川乌。

2.6.3 耳肿胀抗炎实验

昆明小鼠50只,雌雄各半,体重 20±2g,给药前禁食16h,随机分5组,分别为生理盐水对照组、生川乌组、醋制组、药典组、黑豆组,每组10只。每只小鼠按0.1mL/10g(生药0.52g/kg,LD50的 1/10)分别给药,生理盐水组给予等体积的生理盐水,以生理盐水为空白对照组,1h后于小鼠右耳两面涂0.3mol二甲苯致肿,左侧耳朵为对照,1h后处死,用6mm的打孔器冲下左右耳朵相同的部位,在分析天平上称重,以左右耳片重量差表示肿胀程度,记录。实验剂量及结果详见表4。

表4 抗炎实验结果(n=10)

四种川乌不同炮制品对大鼠均具有抗炎作用,与生理盐水组比较有显著差异。其中黑豆法的抗炎作用最为明显,其次是药典法,醋制法和生川乌的抗炎作用比较接近,相对较弱。抗炎作用强度为黑豆法＞药典法＞生川乌＞醋制法。

3 结语

以上实验数据显示,我们可以通过改变川乌炮制工艺从而达到控制川乌炮制品的药效的目的。川乌不同工艺的炮制品对小鼠热板试验具有镇痛作用,生川乌的毒性最为明显,药典法以90～120min最明显,醋制法以 30～60min最明显,黑豆法在30min时镇痛效果较佳,随着时间延长略有减弱。川乌四组不同炮制品对小鼠醋酸扭体的镇痛效果以黑豆法最佳,其次是醋制法,再其次是药典法,作用最弱的是生川乌。

通过本次毒性及药效实验发现,川乌的各种炮制品均能明显抑制二甲苯所制小鼠耳廓肿胀,与生理盐水组相比有着显著的差异;醋酸扭体实验显示川乌不同炮制品能显著减少醋酸所致小鼠扭体次数,延长小鼠扭体潜伏期;热板镇痛实验显示川乌不同炮制品均能延长热板刺激小鼠添足潜伏期,提高热板小鼠痛阀值。综合上述试验,川乌抗炎镇痛功效与煎煮时间、添加辅料、给药剂量等具有显著相关性。由以上实验结果,我们初步认为选择不同炮制辅料、不同浸泡时间、不同炮制时间、不同给药剂量均对川乌的药效产生不同影响,为继续深入研究其工艺条件与药效的关系,寻找最佳炮制方式,以及合理利用中药材资源提供了科学根据。

川乌作为一种传统毒性中药,常被用于临床用药。本实验采用川乌的炮制品通过灌胃研究不同浓度以及不同炮制品对大鼠肝细胞的毒性来探索出一条切实可行的加工处理方法,提高药材的质量,保证临床用药的安全有效,并且通过细胞毒性的实验分析方法,验证不同的炮制品的毒性为选择最佳炮制品提供科学依据。从实验结果可以看出,川乌大毒,少量即可起中毒反应,3～4g即可致死,对心肌细胞和肝细胞都有较大损伤。川乌经炮制后毒性明显降低,小鼠毒性反应强度减弱,以及毒性反应的时间延长。通过以上实验结果,我们可以通过改变炮制工艺使得川乌毒性大大降低的同时使其药效达到最佳,便于医生的合理用药及病人的安全用药。

[1]国家食品药品质量监督管理局.中华人民共和国国药典[R].北京:国家食品药品质量监督管理局,2000.

[2]孟琼华,彭 成.乌头碱对心肌细胞毒性作用机制研究[D].成都:成都中医药大学,2004.

[3]Xu C J.Science of p rocessing Chinesemedicnal herbs(中药炮制学)[M].Shanghai:Shanghai Science Press,1985.

[4]郑 平,杨煜荣.乌头碱镇痛作用部位及其与中枢去甲肾上腺素能系统的关系[J].中国药理学报,1988,9(6):485.

[5]甄 攀,杨凤珍.吴茱萸总生物碱提取条件的考察[J].中国中药杂志,2000,25(8):50～54.

[6]陈 奇.中药药理研究方法学[M].北京:人民卫生出版社,1996.