新疆塔城地区仔猪黄白痢病原菌的分离鉴定及药敏试验

2011-08-22 08:45:44
中国猪业 2011年11期
关键词:塔城市沙湾县菌毛

周 军

(新疆塔城地区畜牧科技研究推广中心,新疆塔城市 834700)

随着肉食品价格的不断升高、国家鼓励政策的实施,养猪业得到了迅速发展,规模养殖不断扩大,而困扰养猪业发展的猪病问题(如仔猪黄白痢)尤为突出。仔猪黄白痢发病率高、死亡率高,严重威胁养殖业的发展,对其研究已成为世界性的重要课题。加之,近年来由于滥用抗生素,使得细菌耐药性产生,在规模化养殖的情况下药物治疗也十分困难。

为调查塔城地区仔猪黄白痢发病和流行情况,指导养猪场用药,更好的从源头预防控制仔猪黄白痢的发生,笔者对塔城地区的仔猪黄白痢病料中的致病菌进行了分离鉴定,同时做了药敏试验。

1 材料

1.1 病料

病料为死亡仔猪肠内容物,来自塔城市、额敏县、沙湾县30家规模较大的养猪场。

1.2 培养基及试剂

鲜血琼脂平板、麦康凯琼脂平板、SS琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、普通琼脂平板;MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、过氧化氢试剂、K88阳性血清、氧化酶试剂等。

1.3 药敏纸片

由北京天坛药物生物技术开发公司生产。

1.4 实验动物

健康小白鼠40只,体重17~24 g,雌雄各半。

1.5 红细胞的制备

分别采集健康猪、绵羊、鸡、兔和豚鼠动物血液,5%的柠檬酸钠抗凝,2000转/分钟 离心,生理盐水洗涤细胞,如此3次,每次10分钟,最后用0.0l mol/L PBS(pH 7.2)稀释到1%的工作浓度。

1.6 主要器材

全自动鉴定及药敏测试仪(ATB Expression)、离心机、GMSX-280手提式压力蒸汽消毒器、数码显微镜、温箱、冰箱、SW-CJ-2FD超净工作台。

2 方法

2.1 病原分离

将采集的病料接种于EC增菌液,37℃恒温培养24小时,转入鲜血培养基37℃恒温培养24小时,再将分离纯化的菌株,接种于麦康凯琼脂平板、SS琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板,37℃恒温培养24小时,观察分离细菌生长的菌落特点,同时将分离菌抹片,革兰氏染色,镜检。

2.2 用细菌鉴定仪鉴定

随机每县市选取一株细菌分别进行鉴定。从山梨醇麦康凯琼脂平板取1~2个纯化的菌落,用生理盐水稀释到0.5个麦氏单位,取细菌菌液200 μL接种于液体培养基,混匀;用连续加样器将带有细菌的培养基,分别加入鉴定条的32个孔,每孔135 μL,盖好鉴定条的盖子,放入温箱30℃恒温培养24小时。打开盖子,用细菌鉴定仪鉴定。

2.3 生化试验

常规生化试验,37℃恒温培养72小时,观察记录结果(见表1)。

2.4 用血凝方法鉴定其K抗原血清型

原理:K88不能凝集绵羊红细胞,但能凝集鸡、猪、豚鼠、兔的红细胞;K99株不能凝集兔的红细胞,但能凝集鸡、猪、豚鼠、绵羊的红细胞;987p全部不凝集;F41全部凝集。当大肠杆菌菌毛粘附于各种动物红细胞上时,能使红细胞发生凝集,且不被D-甘露糖抑制,系一种甘露糖抵抗血凝反应(MRHA)。

菌毛的制备:分别将30株培养好的细菌用0.01 mol/L pH 7.2的PBS洗涤并转移到20 mL灭菌离心管中,8000转/分钟 离心15分钟,称取细菌细胞的湿重,以0.1 g/mL湿重菌量悬浮于0.01 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液中,60℃水浴振摇30分钟脱菌毛,经10000转/分钟 4℃离心15分钟,吸取上清液20 mL置磁力搅拌器上缓慢加入研细的(NH4)2SO4(终浓度为30%),边加边搅拌,待 (NH4)2SO4完全溶解后,置4℃冰箱过夜,4℃15000转/分钟 离心40分钟,沉淀溶于2 mL 0.01 mol/L的PBS中备用。

鉴定方法:先做血凝预试验,以能明显凝集红细胞供试液的最高稀释倍数作为该黏附素抗原的血凝效价。取96孔板每孔加入50μL含1%D-甘露糖的PBS液(共31行5列),前30行每孔加入50 μL菌毛提取液第31行每孔加入 50 μL含 1%D-甘露糖的 PBS液做对照,1~5列依次加入1%的猪红细胞、1%的绵羊红细胞、1%的鸡红细胞、1%的兔红细胞和1%的豚鼠红细胞液50 μL,放微量震荡器上震荡2分钟,然后放到4℃冰箱,3小时后观察结果。

2.5 致病性试验

将小白鼠随机分成4组,每组10只,即塔城市、额敏县、沙湾县及对照组。将分离到的各菌株腹腔注射,每只小鼠3×108CFU的菌液,对照组注射生理盐水0.2 mL/只,观察接种菌液后72小时内小白鼠死亡情况,并将死亡小白鼠的心、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、血液接种于鲜血琼脂平板上,37℃恒温培养24小时,抹片、染色、镜检,观察是否为接种菌株。

表1 30株细菌的生化培养的结果

表2 K抗原鉴定结果

表3 30株细菌人工感染小白鼠致死的结果

2.6 药敏试验

将分离的菌株(30株都进行了药敏试验,由于结果大致相同,所以只选择塔城市、额敏县、沙湾县各一株的数据列入表中)接种于麦康凯平板上,贴上药敏纸片(20种药物),37℃恒温培养24小时,观察抑菌圈直径。

3 结果及分析

3.1 细菌鉴定仪鉴定结果

三株(塔城市、额敏县、沙湾县各选一株)均为大肠杆菌。

3.2 分离细菌的培养特性、形态特征

从病料中采集、分离到的30株细菌,培养特性基本一致。在普通营养琼脂平板上,生长菌落呈圆形、湿润、表面光滑、边缘整齐、乳白色小菌落,接种在麦康凯琼脂平板上呈粉红色圆形菌落;在SS琼脂上呈圆形深红色菌落,在伊红美蓝琼脂上产生黑色带金属闪光的菌落。革兰氏染色镜检为革兰氏阴性小杆菌。其培养特性和外观与大肠杆菌最为相似,初步鉴定为大肠杆菌。

3.3 生化试验的结果

30株细菌的生化培养实验结果基本相同,但有量的差异,见表1。其生化特性均符合大肠杆菌的标准,可判定为大肠杆菌。

3.4 血凝试验K抗原鉴定结果

凡是5种红细胞都不凝集的,为987p(由于这30株细菌在提取菌毛和做血凝试验时,所有的操作是完全相同的,所以由于没有提取到菌毛而与5种红细胞不凝集的可能性几乎没有),见表2。

3.5 动物实验的结果

塔城市、额敏县、沙湾县所分离到的细菌均有致病性,毒力强弱顺序为额敏县>沙湾县>塔城市,见表3。

3.6 药敏试验的结果

塔城市的菌株除了对庆大霉素、头孢曲松敏感,对痢特灵中度敏感外,对其他药物全部耐药;建议塔城市的猪场治疗用药时选用庆大霉素、头孢曲松。

额敏县的菌株除了对庆大霉素、头孢曲松敏感,对氟哌酸中度敏感外对其他药物全部耐药;建议额敏县的猪场治疗用药时选用庆大霉素、头孢曲松。

沙湾县的菌株除了对庆大霉素、痢特灵敏感,对氟哌酸中度敏感外,对其他药物全部耐药;建议沙湾县的猪场治疗用药时选用庆大霉素、痢特灵。总之,三个县市分离到的菌株均对庆大霉素敏感。建议养猪场(户)交叉用药,防止细菌耐药菌的产生(见表4)。

表4 药敏试验数据表

猜你喜欢
塔城市沙湾县菌毛
新疆塔城市农户土地规模经营调查与分析
新疆沙湾县南山温泉地热资源地质特征
浅析牧草收获机械化技术
新农村(2017年5期)2017-05-22 17:19:05
打瓜机械化技术在塔城市的推广示范
新农村(2017年2期)2017-05-20 21:05:41
沙湾县失地农民安置现状及意愿调查分析
产肠毒素性大肠杆菌菌毛的研究进展
塔城市土地整理现状调查与分析
沙湾11月21日举办首届马拉松(半程)比赛
沙湾县文化惠民工程的若干思考
肠炎沙门氏菌SEF14菌毛研究进展