生肌象皮膏对糖尿病大鼠伴肌腱损伤溃疡创面的修复作用

郭 悦，张 杨，孙晓雷，崔 丽，张 玮，李秀兰

溃疡是糖尿病常见和严重的并发症之一，往往反复发作，迁延不愈。本研究通过动物实验观察经生肌象皮膏与贝复济作用后的糖尿病溃疡创面愈合规律和治疗效果。

1 材料与方法

1.1 动物 健康Wistar大鼠20只，体重200～250 g，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心（SCXK-军2007-004）。

1.2 主要试剂及药品 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（Sigma），链脲佐霉素（Sigma），艾科灵睿血糖仪及试纸（艾康生物技术有限公司），贝复济（重组牛碱性成纤维细胞生长因子溶液，珠海亿胜生物制药有限公司），50%乙酸，速眠新Ⅱ注射液（军事医学科学院军事兽医研究所），生肌象皮膏（天津医院，津药制字Z20070614号）。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病大鼠造模 Wistar大鼠适应性饲养1周，禁食不禁水18 h，于尾静脉取血测量初始血糖，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液配制10 mg/mL链脲佐霉素（streptozotocin，STZ）溶液（现用现配），称体重后按照雄鼠45 mg/kg、雌鼠40 mg/kg进行腹腔注射，连续注射3 d。其间自由饮水及喂食。3 d后经血糖仪测定血糖超过16.7 mmol/L，并出现明显多饮多尿，为糖尿病大鼠造模成功。

1.3.2 溃疡创面造模 糖尿病大鼠按30 μL/100 g肌注速眠新，麻醉后，于腰背部剪毛备皮。在无菌条件下，于脊柱两侧各制作直径为1.4 cm的圆形皮肤缺损，缺损间隔约0.5 cm，去除全层皮肤深至肌层，暴露肌腱。用止血钳牵拉及50%乙酸点状涂抹的方式处理创面肌腱，外敷凡士林油纱，连续3 d，直至肌腱出现溃疡或坏死。期间每只大鼠单笼饲养，自由饮水与进食。

1.3.3 分组换药 采用完全随机分组方法将动物分为两组，每组各10只。生肌象皮膏组于创面外敷生肌象皮膏，棉片覆盖；贝复济组创面在无菌条件下于创面先敷以贝复济50 μL，再外敷凡士林油纱。每天清创换药，直至最后处死取材。

1.4 观察指标

1.4.1 血糖 大鼠造模前后血糖值的改变。

1.4.2 创面面积 分别于换药治疗前及治疗3、5、7、9、11、13、15、17、19 d，记录创面变化情况，以硫酸纸描出创面轮廓，用称重的方法换算出创面面积。

1.4.3 创面愈合率 计算公式：创面愈合率=（原始创面面积-现创面面积）/原始创面面积×100%。

1.4.4 组织学显微观察及超微结构观察 分别于治疗4、7、10、15 d，应用角膜钻于创面取材，10%中性福尔马林固定，切片，进行HE染色，光镜观察；6%戊二醛固定后切片进行透射电镜观察。

1.5 统计学分析 用SPSS17.0进行统计学分析，数据以均数±标准差（±s）的形式表示，组间差异应用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 糖尿病大鼠模型 经链脲佐霉素攻击后的大鼠出现明显多饮多尿，精神萎靡，3 d后血糖为（20.52±3.43）mmol/L，造模成功率100%。

表1 大鼠糖尿病造模前后体重、血糖值（±s）

表1 大鼠糖尿病造模前后体重、血糖值（±s）

注：与造模前比，*P＜0.05

n造模前造模后20 20体重(g)223.27±17.78 205.48±11.61*血糖值(mmol/L)5.36±0.34 20.52±3.43*

2.2 肌腱损伤溃疡创面 经过化学及机械处理后的肌腱均出现明显溃疡及坏死，造模成功率100%，见图1、图2。

图1 未经处理的创面，肌腱暴露

图2 造模成功的肌腱坏死溃疡创面

2.3 创面面积 生肌象皮膏组从换药第15 d起，各检测时间点的创面面积均小于贝复济组（P＜0.05），见图3。

图3 两组治疗方法不同时间点创面面积比较

2.4 创面愈合率 生肌象皮膏组从换药第15 d起，各检测时间点的创面愈合率始终高于贝复济组（P＜0.05），见图4。

图4 两组治疗方法不同时间点创面愈合率比较

表2 两组治疗方法不同时间点创面面积及愈合率比较（n=10，±s）

表2 两组治疗方法不同时间点创面面积及愈合率比较（n=10，±s）

注：与贝复济组比较，*P＜0.05

组别治疗前治疗3 d治疗5 d治疗7 d治疗9 d治疗11 d治疗13 d治疗15 d治疗17 d治疗19 d生肌象皮膏组创面面积（cm2）2.15±0.31 1.79±0.37 1.51±0.39 1.14±0.38 1.02±0.36 0.86±0.11 0.69±0.15 0.54±0.13*0.44±0.11*0.31±0.11*创面愈合率（%）0 17.37±8.17 30.50±11.40 47.45±13.43 53.06±12.76 59.87±5.60 67.84±7.11 74.89±5.71*79.28±4.80*85.75±5.13*贝复济组创面面积（cm2）2.15±0.23 1.93±0.19 1.71±0.24 1.46±0.27 1.24±0.32 1.05±0.27 0.89±0.19 0.79±0.19 0.69±0.21 0.55±0.18创面愈合率（%）0 9.8±7.54 19.85±13.18 35.24±11.75 45.31±13.78 53.51±11.37 60.67±8.42 65.16±8.03 69.42±9.35 75.60±7.93

2.5 组织学HE染色 糖尿病大鼠伴肌腱损伤溃疡创面的愈合，符合慢性创面愈合病理过程，包括炎症反应，新生血管和肉芽组织生成，纤维结缔组织成熟和上皮化过程。创面愈合4 d处于炎症反应期，两组均可见到急性细胞反应和组织坏死及渗出（图5a）。生肌象皮膏组可见新生的毛细血管以出芽的方式生成，可见到活跃的成纤维细胞，为新生的肉芽组织表现，可见大量活跃的巨噬细胞（图5b）。贝复济组创面组织有少量细菌团，未见肉芽组织新生表现（图5c）。创面愈合7～10 d，两组均以肉芽组织生成为主要表现，但程度上生肌象皮膏组较贝复济组明显，新血管形成，内皮细胞增生活跃，成纤维细胞大量形成，并有胶原纤维生成（图5d），可见新生的上皮细胞（图5e）。创面愈合15 d，两组均出现上皮化，鳞状上皮出现（图5f），部分区域可见角化层。溃疡创面明显缩小，生肌象皮膏组与贝复济组的缩小程度差异显著。

图5 肌腱损伤溃疡创面愈合不同时期的组织学HE染色观察

2.6 透射电镜 创面愈合初期两组均可见炎症反应，生肌象皮膏组可见活跃巨噬细胞，内含有大量的吞噬颗粒、溶酶体，细胞器发达（图6a），伪足伸出明显呈活跃状态。肉芽组织生成期可见大量的肉芽组织，新生毛细血管逐渐粗大，由多个内皮细胞组成（图6b），周细胞紧紧贴附于内皮细胞边缘。可见幼稚的成纤维细胞呈多角形，胞浆丰富，细胞器发达，细胞核较大，核仁明显（图6c）。成熟的肉芽组织，成纤维细胞胞浆丰富，线粒体发达（图6d），成纤维细胞成群排列。

3 讨论

STZ对一定种属动物的胰岛β细胞有选择性破坏作用，能诱发许多动物产生糖尿病，一般采用大鼠和小鼠制造动物模型。针对STZ使用剂量、给药次数及其对胰岛损伤程度方面的研究，各方报道不尽相同[1-2]。本实验针对不同性别的大鼠给予不同剂量的STZ，最终麻药用量都是在经过多次预实验的基础上选定的，符合本实验室的实验条件。

正常创口愈合是个复杂而有序的过程，包括止血和炎症阶段、增生阶段和塑形阶段。多种细胞、细胞因子和细胞外基质之间错综复杂的网络作用是该过程中的关键因素[3]。创面愈合的基础是炎症细胞如巨噬细胞、中性粒细胞以及修复细胞如成纤维细胞、表皮细胞等的一系列生物学活动，其中巨噬细胞除吞噬消化组织细胞碎片外，同时还可分泌多种生长因子，是刺激成纤维细胞增殖分化，合成胶原蛋白的关键因素。然而在糖尿病溃疡的早期，创面内的炎性细胞主要是以中性粒细胞为主，浸润不明显，巨噬细胞数量少且出现晚，致使创面炎症期持续时间长[4]，创面局部的成纤维细胞和表皮细胞的分裂繁殖速度减慢和细胞外基质合成减少、分解加速，成为创面经久不愈的病理基础。表皮细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子等促进伤口愈合的细胞生长因子及E-选择素，细胞内黏附分子-1，血管细胞黏附分子-1等黏附分子的合成和分泌减少，包括胶原酶在内的各种金属蛋白酶的合成和分泌增加，是导致慢性难愈性创面病理变化的分子生物学基础[5]。

图6 肌腱损伤溃疡创面愈合不同时期的透射电镜观察

贝复济主要成分为重组牛碱性成纤维细胞生长因子，对来源于中胚层的细胞(如真皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等)具有促进修复和再生作用，即可促进肉芽组织形成和再上皮化，也就是在创面愈合的增生阶段起主要作用。它能促进毛细血管再生,改善局部血液循环,从而加速创面的愈合。但它对于缩短炎症阶段作用并不显著。

生肌象皮膏主要成分为象皮粉、全当归、生地、生龟板、炉甘石、生石膏、血竭、血余炭、黄蜡、白蜡、麻油，具有抗菌消炎、清热解毒、镇痛止血、养血活血、敛疮收湿、祛腐生肌之功效，既根除外在病灶之标,又兼顾充实其本,故收效甚佳。对生肌类外用中药的研究表明,生肌类中药影响创面愈合存在很多因素,除创面血运、成纤维细胞及Ⅰ、Ⅲ型胶原、创面免疫力、纤维结合蛋白、微量元素、pH值、生长因子(表皮生长因子受体、血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子)等外,还有细胞外基质、表皮细胞及多种细胞因子的作用[6]。李秀兰等[7]对中医外科传统的疗疮愈伤法则——“偎脓长肉”的作用机制进行了一系列研究，指出生肌象皮膏的抗感染作用不是直接抑菌，而是提高机体的免疫功能，是良好的免疫促进剂。它增加创面毛细血管通透性，使创面产生大量与西医所指的脓有本质区别的有益“脓”，是一种来自于局部微血管的营养液，富含免疫活性细胞和免疫活性因子，可以有效地调节创面组织细胞的功能，从而抗感染和促进组织愈合。这也是生肌膏等外用中药治愈一般西药难以治愈的感染创面的根本原因。此外，生肌象皮膏治愈率高，患者痛苦少，不需大量抗生素辅助治疗，换药不需要严格无菌操作等优势，使其应用更便利。在本实验中，通过组织学观察发现，生肌象皮膏组巨噬细胞出现早、功能活跃，这说明生肌象皮膏可促进巨噬细胞的激活，加强巨噬细胞趋化性，增强其吞噬功能。由此进一步促进了各种生长因子的分泌，加速肉芽组织形成、上皮化，达到促进溃疡创面愈合的目的。

腹腔注射STZ，再选用化学和机械损伤方法损伤肌腱是建立糖尿病大鼠肌腱损伤溃疡创面模型的有效手段，可作为临床药物对糖尿病足肌腱损伤溃疡创面愈合疗效评价的动物实验模型。本实验观察发现，生肌象皮膏组创面缩小程度及创面愈合效果均优于贝复济组,其具体作用机制尚待进一步研究。

[1]闻智鸣.不同剂量和不同给药次数的链脲霉素对大鼠胰岛的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2004,9(10):1128

[2]相胜敏,王健.糖尿病足动物模型及其特点[J].中国中西医结合外科杂志，2007,13（3）:306.

[3]张臻,阙华发,朱元颖，等.益气化瘀中药对大鼠糖尿病皮肤溃疡TGF-β受体的影响[J].中国中西医结合外科杂志，2008,14(5):487

[4]王如然，常柏.生肌象皮膏对糖尿病大鼠难治性溃疡创面肉芽组织病理结构的影响[J].中国现代医学杂志，2008,18(17):2451.

[5]Werner S,Grose R.Regulation of wound healing by growth factors and cytokines[J].Physiol Rev，2003,83(3):835.

[6]易成刚，郭树忠，陈建宗.生肌类中药的理论与实验研究[J].中国临床康复，2004,8(29)：6470.

[7]李秀兰，徐尔真，师宜健，等.生肌膏等外用中药“偎脓长肉”作用机制 [J].医学研究通讯，1998,27（6）：20.