口腔拭子在药物性耳聋基因检测中的应用

张琼敏，郑静，宋攀攀，朱翌，陈晓云，管敏鑫

（1.温州医学院附属第一医院 耳鼻咽喉科，浙江 温州 325000；2.温州医学院 生命科学学院，浙江 温州 325035）

位于高度保守的12S rRNA基因解码区的同质性A1555G和C1494T突变可导致其携带者对氨基糖甙类药物超敏感[1-4]。开展线粒体DNA A1555G和C1494T突变筛查，可从根本上减少对氨基糖甙类药物敏感的个体发生药物性耳聋。外周血作为基因检测的主来样本来源，具有基因含量丰富、存储方便等优点，然而抽血是有侵入性的操作，并且需要相应的人力物力才能完成。如果以血液作为唯一的基因来源势必会给基因筛查的实验研究及临床运用造成诸多不便。那么简易无损的口腔黏膜拭子是否可以取代血液完成药物性致聋基因的检测？其成功率与可靠性如何？本实验做了深入的研究。

1 材料和方法

1.1 对象及材料 温州特殊教育学校非综合征型耳聋学生97例（男57例，女40例，平均年龄13岁）。取被检者口腔黏膜拭子3根于信封中室温贮存，并取静脉血2 mL，EDTA抗凝于冰箱4 ℃贮存。以上工作均按照温州医学院伦理委员会管理规定，在患者及其家属成员签定知情同意书下完成。

1.2 试剂与器材 细胞裂解液（10 mmol/L Tris·HCl、1 mmol/L EDTA、0.1% SDS）、蛋白酶K、冰醋酸钾（3 mol/L KAC、5 mmol/L CH3COOH）、异丙醇、75%酒精，QIAamp DNA Mini Kit（50）（德国QIAGEN生物公司），Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0（大连宝生物工程有限公司），TaKaRa Ex Taq（大连宝生物工程有限公司），DL2，000TMDNA Marker（大连宝生物工程有限公司），Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（大连宝生物工程有限公司），引物合成由大连宝生物工程有限公司完成。MyCycler Thermal Cycler 170-9703 PCR 扩增仪（BIO-RAD公司），DYY-III-8B稳压稳流型电泳仪（北京六一仪器厂），Gene Genius Bio imaging sys-tem紫外凝胶分析系统（SynGene公司），Thermo Scientific nanodrop2000spetrophotometer超微量分光光度计（北京星越生物科技有限公司），所有测序工作均由北京华大基因公司完成。

1.3 方法

1.3.1 口腔拭子的获取：取1根普通医用消毒棉签反复刮拭受检者面颊内壁黏膜6次（受检者30min内未进食），空气中干燥后贮存于干净的信封中室温保存。

1.3.2 口腔拭子DNA的提取：手工法：用消毒后的镊子将风干的口腔拭子表面的硬质棉花撕脱，置于2 mL的EP管中，加入600 mL细胞裂解液及3 mL蛋白酶K混匀，放入55 ℃的恒温水浴箱中孵育90 min，加入600 mL -20 ℃预冷的冰醋酸钾，颠倒混匀，冰浴10 min，4 ℃离心（12500 r/min，10 min），将上清液移至装有600 mL预冷的异丙醇的EP管中并混匀。置于-20 ℃的冰箱中30 min，常温离心（12500 r/min，20 min），弃去上清液。加入600 mL 75%乙醇，小心吹打混匀，离心（12500 r/min，7 min），弃去上清液，静置干燥待酒精挥发至无味时加入20 mL高压去离子水。

试剂盒法：按QIAampDNA mini Kit（50）试剂盒的说明书要求提取DNA。

1.3.3 静脉血DNA的提取：按TAKERA DNA EXTRACTION KIT试剂盒说明书提取。

1.3.4 口腔拭子及静脉血DNA浓度及纯度的测定：用超微量分光光度计测定DNA溶液的A260值及A260/A280值来衡量DNA的浓度及纯度。

1.3.5 基因扩增：使用Primer 5.0软件和Oligo7.0软件根据人类线粒体基因序列（GenBank登录号：AC_000021）设计引物Mit-2F、Mit-2R。上游引物5’-CGA TCA ACC TCA CCA CCT CT-3’，下游引物5’-TGG ACA ACC AGC TAT CAC CA-3’，引物由大连宝生物公司合成。Mit-2F、Mit-2R用于扩增包含A1555A及C1494C野生型位点的线粒体基因。在25 mL反应体积中，取口腔黏膜拭子或全血的样品DNA 25 mL，10 mmol/L引物正反向各0.2 mL，0.2 mmol/L d-NTP 2 mL，10×PCR缓冲液2 mL，25μmol/L MgCl21.5 mL，5 U/mL Taq酶0.1 mL，ddH2O 18 mL。PCR仪上94 ℃ 5 min热变性后，94 ℃ 30 s→55 ℃30 s→72 ℃ 30 s，循环35次，72 ℃延长10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.3.6 测序及数据分析：口腔拭子及静脉血DNA的PCR产物送上海华大基因公司直接测序，测序结果使用Gentle软件与人类线粒体标准序列校正后的人类线粒体DNA剑桥参考序列（Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence，Last updated 2008-2-16）进行比对，发现A1555G及C1494T的突变后用Chromas 2.0软件读取测序结果的峰图文件，进行确认或排除。

1.4 统计学处理方法 3组DNA浓度及纯度数据均符合正态分布，采用单因素方差分析、LSD-t检验及卡方检验。

2 结果

2.1 DNA浓度及纯度 采用手工法提取的口腔拭子DNA量与使用试剂盒法差异无统计学意义（P>0.05）。而手工法提取的DNA纯度指标A260/A280低于使用试剂盒法，两组间差异有统计学意义（P<0.05）。试剂盒法与手工法提取的基因组DNA的PCR成功率与外周血差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 不同样本来源的DNA浓度、纯度及PCR成功率

2.2 口腔拭子及静脉血DNA PCR产物的电泳条带比较 静脉血及口腔拭子的扩增产物均停留在802 bp附近，且扩增效果一致，结果见图1。

图1 PCR扩增产物电泳图

2.3 口腔拭子及静脉血DNA PCR产物送测结果及峰图 口腔拭子DNA的PCR产物完全符合测序对模板的要求，97例均可得出测序结果峰图。两组样本的测序结果相一致，均显示A1555G突变阳性2例，阴性95例。C1494T突变97例均为阴性。

口腔拭子DNA扩增产物的测序峰如图2。图2A显示的是静脉血DNA扩增产物测定为A1555G突变阳性的耳聋患者的口腔拭子的实验结果，图2B显示的是A1555G突变阴性的耳聋患者的口腔拭子的实验结果，图2C显示的是C1494T突变阳性耳聋患者的测序峰图（本研究试验结果中无阳性结果，仅作对比参考），图2D显示的是C1494T突变阴性的耳聋患者的口腔拭子的实验结果。

图2 PCR产物扩增的结果判定图

3 讨论

近年来，基因检测技术发展颇为迅速，而在样本取材（DNA来源）上却鲜有突破性的进展。血液中的病原体有潜在的致病风险。抽血给许多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时也存在一定的麻烦。此外抽血的高成本费用成为基因检测普及的制约因素[5]。目前，国内尚无报道采用血液以外的其他样本作为致聋基因检测的DNA来源的研究。因此，迫切需要一种简便无损的基因获取方法以满足对耳聋基因突变进行检测乃至广泛筛查的需要。国内外科研力量也在提取DNA方面不断的尝试寻求可以取代血液的其他生物检材，如采用脱落的口腔黏膜上皮、毛囊、精液等各种可能含有DNA的人体检材[6-7]。在口腔黏膜上皮的收集方式上，文献[8]报道过口腔细胞刷、口腔黏膜拭子、牙签、漱口等多种方式。其中漱口法的DNA产量是相对最高的[9]，但是样本的处理却相对麻烦[10]。口腔黏膜拭子取材及样本处理过程都更为简易，故本研究采集患者的口腔黏膜拭子，通过简单又相对无毒性的细胞裂解法及试剂盒法提取DNA进行PCR反应并测序。

口腔拭子是否可以取代血液成为DNA来源，关键在于其样本的储存稳定性及可提取的DNA的量和纯度是否满足PCR的要求。相关研究已表明风干后的口腔黏膜上皮标本在室温储藏条件下2周内会一直保持稳定的状态[10]。并且样本DNA的产量与一定期限内的储存时间并不存在明显的相关性[1-4]。分析本研究结果，可发现口腔拭子中提取的DNA的PCR成功率与血液DNA差异无统计学意义，且两种方法提取的DNA基本都可以满足药物性致聋基因的扩增。其中失败的手工法2例及试剂盒法3例的DNA浓度均小于10 ng/mL，可能是浓度过低引起PCR的失败。从表1也可以看出单根口腔拭子提取的DNA产量波动性是较大的，这是由单根拭子口腔上皮细胞的采集不可量化而造成的结果。可以通过同时提取数根口腔拭子DNA来避免波动性过大引起的产量过低的问题。DNA获得成功扩增的口腔拭子的测序结果与相应的血液的结果完全符合，说明采用口腔拭子进行基因检测结果是完全可靠的。另外，通过对两种口腔黏膜拭子DNA提取方法的比较发现，试剂盒法所提取的DNA纯度较手工法高，但是价格昂贵，平均每根口腔拭子成本为30元人民币，而手工法每根成本仅为3元人民币。从利于药物性耳聋基因检测的普遍开展的角度出发，手工法提取口腔拭子DNA更适宜。

本项对比研究结果表明口腔黏膜拭子据有操作简单、价格低廉的优势，可以代替静脉血成为基因组DNA的另一来源途径，并可以其无损伤性应用于新生儿、精神病人及不愿意提供血液人群的药物性耳聋基因的检测，具有较高的临床应用价值。

[1] Guan MX. Molecular pathogenetic mechanism of maternally inherited deafness[J].Chinese Journar of Otology, 2003,1(3):49-57.

[2] Fischel-Ghodsian N. Genetic factors in aminoglycoside toxicity[J]. Pharmacogenomics,2005,6(1):27-36 .

[3] Zhao H, Li R, Wang Q, et al. Maternally inherited aminoglycoside-induced and nonsyndromic deafness is associated with the novel C1494T uutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family[J]. Am J Hum Genet,2004,74(1):139-152 .

[4] Zhao H, Young WY, Yan Q, et al. Functional characterization of the mitochondrial 12S rRNA C1494T mutation associ-ated with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss[J]. Nucleic Acids Res ,2005,33(3):1132-1139.

[5] Le Marchand L, Lum-Jones A, Saltzman B, et al. Feasibility of collecting buccal cell DNA by mail in a cohort study[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2001,10(6):701-703.

[6] 刘奇才,程祖建,范海明,等. 毛囊COL4A5基因扩增的方法学研究[J].中国实验诊断学, 2007,11(8):1082-1084.

[7] 安娜,欧阳翔英,曹采,等. 颊拭子样本检测牙周炎相关基因的应用[J].现代口腔医学杂志, 2004,18(2):121-124.

[8] Garcia-Closas M,Egan KM,Abruzzo J,et al. Collection of genomic DNA from adults in epidemiological studies bybuccal cytobrush and mouthwash[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2001,10(6):687-696 .

[9] Ellen M, Nathaniel W, Kristen A, et al. Use of buccal cells collected in mouthwash as a source of DNA for clinical testing[J]. Arch Pathol Lab Med,2001,125(1):127-133.

[10] Harty LC, Garcia-Closas M, Rothman N, et al. Collection of buccal cell DNA using treated cards[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2000,9(5):501-506.

[11] van Wieren-de Wijer DB, Maitland-van der Zee AH, de Boer A,et al.Determinants of DNA yield and purity collected with buccal cell samples[J]. Eur J Epidemiol,2009,l 24(11):677-682.