鸽圆环病毒福建株全基因组序列分析

2011-08-21 01:55万春和程龙飞傅光华施少华陈红梅
中国动物传染病学报 2011年5期
关键词:密码子圆环基因组

万春和,黄 瑜,程龙飞, 傅光华, 施少华, 陈红梅

(福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州 350013)

圆环病毒科(Circoviridae)包括2个属:圆圈病毒属(Gyrovirus)和圆环病毒属(Circovirus)。圆圈病毒属只有鸡贫血病毒(Chicken infectious anemia virus, CIAV)一个成员;而圆环病毒属目前有包括猪圆环病毒(Porcine circoviruses, PCV1 、PCV2)I型和II 型、鹦鹉喙羽病毒(Psittacine beak and feather disease virus, BFDV)[1]、鸽圆环病毒(Pigeon circovirus, PiCV)[2]、鹅圆环病毒(Goose circovirus,GoCV)[3]、鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)[4]、金丝雀圆环病毒(Canary circovirus,CaCV)[5]、渡鸦圆环病毒(Raven circovirus, RaCV)[6]、八哥圆环病毒(Starling circovirus,StCV)[7]、雀圆环病毒(Finch circovirus, FiCV)、鸥圆环病毒(Gull circovirus,GuCV)[8]和天鹅圆环病毒(Mute swans (Cygnus olor)circovirus, SwCV)[9]等。

鸽圆环病毒(GoCV)最早于1993年在美国报道[10],此后在加拿大[11]、澳大利亚[12]、德国[2]、英国[3]、法国[13]、比利时[14]、意大利[15]和美国[16]均发现有感染报道。余旭平等[17,18]最早在中国浙江省检测到鸽圆环病毒感染,并对浙江省鸽圆环病毒的基因组结构进行分析。本文根据GenBank登录已发表的PiCV序列设计引物,对来自福建省某信鸽养殖厂送检病料进行PiCV检测,通过反向PCR技术获得全长基因序列,并进行生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂蛋白酶K(Proteinase K)和十二烷基硫酸钠(SDS) 购自Sigma公司;DreamTaq Green PCR Master Mix购自Fermentas公司;DNA Marker(DL2000)和pMD18-T载体均购自宝生物工程(大连)有限公司;胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒均购自Omega;大肠杆菌DH5α感受态细胞自制。

1.2 病料处理及核酸提取参考文献[19],实验病料为来自福建省某信鸽场,采集送检信鸽肝脏和脾脏。将组织以无菌PBS(pH 7.4)1: 5按常规方法匀浆后,反复冻融3次。提取鸽圆环病毒基因组DNA步骤:取1 mL组织匀浆液于室温10 000×g离心5 min,取540μL上清,加入60μL 10% SDS于37℃水浴作用30 min,加入15μL蛋白酶K(20 mg/mL),混匀后于56℃水浴作用2 h,间或摇匀。取出后分别置于95℃ 和-20℃各5 min后,加入等体积Tris饱和酚,混匀后静置15 min后,4℃ 12 000×g离心10 min。取离心上清再次加入等体积Tris饱和酚,重复离心。取离心上清加入1/10(上清体积)pH 5.2 醋酸钠溶液和1/10(上清体积)异丙醇,混匀后置于-20℃过夜后,4℃ 12 000×g离心10 min,弃上清,挥发片刻后加入30 μL灭菌去离子水重悬,-20℃备用。

1.3 鸽圆环病毒基因的PCR扩增参考文献[16]设计引物,扩增的目的片段大小约为759 nt。引物序列 为 P1F:5'-GATGACTTCTACGGCTGGCTGCC-3'、P1R: 5'-ACGGCAAACCAGTCGGCAGCAACC-3'。PCR采用50μL体系:DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL、上下游引物(引物浓度为20 mmol/L)各 1μL、DNA 模板 1μL、加双蒸水至终体积为50μL。反应条件为:94 ℃预变性5 min,随后进行94 ℃变性50 s、53 ℃退火35 s、72℃延伸1 min循环,35个循环后,72℃延伸10 min。反应结束后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。将PCR产物目的片段经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,用双酶切和PCR方法鉴定重组质粒,随机选取3个阳性重组质粒送由上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.4 病毒全基因组的测定根据1.3中的测序结果,参考GenBank中鸽圆环病毒登录的序列设计一对反向引物(invers-primer)用于扩增病毒基因组余下的基因片段P2F:5'-TCACTTCACATTCATAATACAT-3'、P2R: 5'-TGCTGGTCACTATTATCACGC-3'。扩增片段大小约1560 nt,引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应条件为:94℃预变性5 min,随后进行94℃变性 50 s、52℃退火35 s、72℃延伸 100 s,35个循环后,72℃延伸10 min。反应结束后,经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。将PCR产物目的片段经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,用双酶切和PCR方法鉴定重组质粒,随机选取3个阳性重组质粒送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.5 全基因序列分析将测序结果与GenBank中登录的序列进行分析,用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行序列整理和校对,将拼接后的核苷酸序列,分别与GenBank中登录的鸽圆环病毒(GenBank登录号见表1)进行同源性比较,用MEGA4.1绘制遗传进化树[20],以鹅圆环病毒株(GenBank登录号GU320569)作为外支(outgroup),用Bootstrap对进化树的可靠性进行评价,重复1000次。

2 结果

2.1 测序结果应用Lasergene v 7.1 DNAStar软件分析序列测定结果,并进行序列拼接后获得PiCV-fj1株病毒基因组全长2037 nt(GenBank登录号JN183455)。分析可得,该株病毒ORF-V1(41~994nt) 编码复制相关结构蛋白(the replicated-associated protein,Rep),ORF-C1(1987~1166nt)编码核衣壳蛋白(the putative capsid protein,Cap)。在2个主要编码区外,还存在有2个可能与病毒复制有关的基因间区(intergenic region):其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′断之间的区域,由2个反向的重复序列构成了一个发夹结构(见图1),其顶部有1个保守的9碱基序列“TAGTATT①AC”(①position 1)。其在茎环结构的下游还存在有反向重复序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG),N表示碱基不完全互补;其3′端基因间区长度为171nt。

图1 鸽圆环病毒福建株5′基因间区结构图Fig.1 The 5'intergenic region of Pigeon circovirus fj1 strain

2.3 核苷酸同源性比较应用Lasergene v7.1DNAStar软件(By Clustal W Method Sequence Distance),将拼接后核苷酸序列,与GenBank登录的所有的鸽圆环病毒全基因序列进行同源性比较,结果见表1。与比利时分离株Bel936同源性最高,达93.8%;与澳大利亚分离株Dove同源性最低,仅84.5%。

2.4 遗传进化分析以GoCV作为外支,运用MEGA4.1绘制鸽圆环病毒福建株fj1和GenBank登录的所有鸽圆环病毒遗传进化树,并用Bootstrap评价进化树的可靠性,重复1000次,结果见图2。可见,鸽圆环病毒在遗传进化上分为2个明显的分支,以编码核衣壳蛋白(ORF-C1,Cap蛋白)起始密码子“ATA”和“ATG”的差异(见表1)分为ATA分支和ATG分支(fj1§为鸽圆环病毒福建株)。

3 讨论

3.1 到目前为止,圆环病毒属除PCV(PCV1和PCV2)可以在PK-15细胞中繁殖外,其余成员均尚未能细胞培养,大大限制了对其进行深入研究。圆环病毒为无囊膜、二十面体对称的动物病毒,其复制需要依赖于旺盛的宿主细胞活力,增殖速度快的淋巴细胞是圆环病毒侵染的主要宿主。因此,圆环病毒感染往往导致机体免疫混乱、免疫力下降,进而引起多种条件性病原的二次感染,鸽感染圆环病毒后可表现为昏睡、食欲降低、体重减轻等症状[10-16,18,21]。本研究中福建某地送检的信鸽检测到PiCV感染,由于PiCV既可通过粪便等污染物水平传播,又可经鸽胚垂直传播[22],提示我们在信鸽引育种环节应注意相关感染的监测。

3.2 本实验株fj1基因组全长为2037 nt,与比利时分离株Bel936同源性最高,达93.8%;与澳大利亚分离株Dove同源性最低,仅84.5%,和余旭平报道的稍有差异。经分析fj1基因组编码2个主要ORF(见表1):复制相关rep蛋白编码的ORFV1(41~994nt), 外 壳 蛋 白 cap 编 码 的 ORF-C1(1987~1166 nt)。在病毒的两个主要编码区外还存在有2个可能与病毒复制、增殖相关的基因间区:其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′端之间的区域,fj1株长度为90 nt,其他鸽圆环病毒5′端间区长短略有差异,主要集中在90~101 nt之间(数据未给出),由2个反向的重复序列构成了一个发夹结构,

其顶部有1个保守的9碱基序列“TAGTATT①AC”(①position 1)。其在茎环结构的下游还存在有反向重复序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG) ,一般认为该病毒是通过滚环模式进行核酸复制,反向PCR扩增剩余病毒基因组片段也正是基于上述特点。其ORF-C1编码的Cap蛋白起始密码子有2类,除常见的“ATG”外还有“ATA”,这和其3′端基因间区长度为171 nt或170 nt有关:3′端基因间区长度为171nt,其ORF-C1起始密码子均为“ATG”,而3′端基因间区长度为170 nt,其ORF-C1起始密码子均为ATA(见表1)。

表1 fj1株与其它鸽圆环病毒全基因核苷酸同源性分析Table1 Homology identity analysis all of the nucleotide in the genus Pigeon circovirus

图2 鸽圆环病毒遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Pigeon circoviruses

3.3 对GenBank中登录的所有鸽圆环病毒全基因序列进行遗传进化分析(图2),可见鸽圆环病毒在遗传进化上分为两个明显的分支。结果分析表明,两个独立遗传进化分支与编码核衣壳蛋白(ORF-C1,Cap蛋白)起始密码子碱基(ATA和ATG)(见表1)相一致,其中Cap蛋白起始密码子为“ATA”为一个分支,而Cap蛋白起始密码子为“ATG”均处在另外一个分支。本实验株和我国浙江分离株均处在“ATG”分支,但分处不同的亚群,提示我国PiCV的感染和进化可能有不同的进化来源或独立进化的时间较长,相关遗传进化与编码Cap蛋白起始密码子的关联还需要更多更深入的研究。

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