长春地区RhD(-)基因型分析

2011-08-20 10:39于晓丽焦立新
中国实验诊断学 2011年10期
关键词:外显子血型等位基因

于晓丽,焦立新

(长春市中心血站,吉林 长春 130033)

Rh血型是目前被国际输血协会(ISBT)认定的29个红细胞血型系统中最具复杂性和多态性的血型系统,它是继ABO血型发现后临床意义最大的一个血型。主要抗原有D、C、c、E、e,其中D 抗原具有高度免疫原性,最具临床意义[1]。

1 资料与方法

1.1 对象长春地区随机抽取Rh阴性献血者血样60名。

1.2 间接抗人球试验确认RhD(-)血液

将60名阴性献血者的血样编号1-60,将其洗涤三次后配成5%红细胞悬液,各取1滴加入试管中,再向试管中加入2滴IgG的抗D试剂(上海血液生物医药有限公司),37℃孵育30分钟。孵育30分钟后用生理盐水反复洗涤3次。弃尽上清,再向试管中加入广谱抗人球蛋白试剂(上海血液生物医药有限公司),1000转1分钟离心,观察结果,有凝集者为RhD(+),无凝集者为RhD(-)[2]。

1.3 基因组DNA提取

使用invitrogen DNA Isolation Kit(invitrogen Corporation,Wisconisin,USA)Lot:038 Batch:46481,按照说明书流程操作,从全血中提取基因组DNA。

1.4 序列特异性引物PCR(sequence-specific primer polymerase chain reaction,PCR-SSP)-琼脂糖凝胶电泳

1.4.1 2.5%琼脂糖凝胶的准备 将2.5 g琼脂糖加入100 ml×TBE溶液(Tis-硼酸盐-EDTA溶液),加热直到形成均匀的凝胶溶液。再加入5 μ l EB,混合均匀。将混合好的凝胶溶液倒入凝胶槽内,插入电泳梳,待冷却后拔出电泳梳备用。

1.4.2 序列特异性引物PCR 筛选RHD(-)血液标本基因型采用天津秀鹏生物科技有限公司生产的特异性引物(引物包被在引物板上),特异性检测RHD基因的第1、5、6、7外显子和845A/G 和1227A/G等位基因。一份样本检测4个外显子和4个等位基因。PCR反应体系总体积为50 μ l。含5 U Taq聚合酶(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司),200 μ mol/L dNTPs,模板 DNA 10 μ l(80-100 ng/μ l)。 在BIO-RAD iCycler DNA扩增仪96℃预变性2 min,随后96℃变性20 s,64℃退火50 s,72℃延伸45 s共32个循环。扩增产物进行凝胶电泳分析。

1.5 分析扩增条带

2 结果

2.1 间接抗人球蛋白实验结果在60名Rh阴性献血者中RhD(-)标本60例。

2.2 PCR-SSP结果在60例RhD(-)样本中,1名为 DVIⅢ型 、5名为弱D15、7名为1227DEL、9名RHDCE(2-9)-D、38名为真正的RHD基因缺失(表1)。

表1 60例RhD(-)标本PCR扩增条带分析

图1 RHD基因外显子和等位基因的PCR-SSP检测结果

3 讨论

Rh血型系统是能引起输血反应和新生儿溶血反应的重要血型系统。其主要有D、C、c、E、e五种抗原,以D抗原为最强,往下依次是E、C、c、e[3]。起初基于白种人的研究认为,RhD(+)者红细胞表面存在D抗原,而RhD(-)者红细胞表面不存在D抗原。但后来的研究发现在非洲黑人、澳大利亚人、日本人中一些 RhD(-)者存在部分或完整的D抗原[4],它的产生涉及复杂的基因变化。这种含有极弱D抗原的RhD(-)血液输注到真正RhD(-)即RHD基因缺失患者的体内就会导致其产生抗D抗体。当再次输注这样的血液后,就会产生严重的溶血性输血反应。因此对其基因的变化及分布规律进行深入研究具有重要意义。

RH基因由RHD基因和RHCE基因两个组成,它们各含有10个外显子。RHD基因编码D抗原,RHCE基因编码C和E抗原。起初认为RhD(+)者携带 RHD基因和RHCE基因,而RhD(-)者只有RHCE基因而无RHD基因存在。但后来的研究发现一些东方人群中,RhD(-)者红细胞表面存在部分或完整的RHD基因[5]。这种RhD变异体的形成涉及了复杂的分子生物学变化,主要为 RHD和RHCE等位基因发生融合、细胞外环错义突变、外显子缺失和等位基因被替换等机制[6-9]。经研究证明这些RhD的变异表型主要包括弱D、部分D和DEL型。在中国人群中,尤以弱D15、RHD-CE(2-9)-D、1227DEL较常见。国内外学者研究发现:利用12种单克隆抗体对2名弱D15的个体做抗原表位检测,发现 5种克隆抗体显现阴性反应,包括LHM174/102、LHM77/64、LHM70/45、LHM59/19、LHM57/17,这说明弱D15型人红细胞表面存在第1、8、9抗原表位的缺失[10-11]。还有学者对弱D15型人的RHD基因的第6号外显子进行研究,结果发现在6号外显子上均存在碱基突变845G〉A,编码序列其它部分与正常 RHD序列相同[5]。RHD-CE(2-9)-D主要是由于RHD基因的第2-9号外显子被RHCE基因所替换,导致不能编码正常的RhD蛋白,形成个体D抗原阴性表型[12]。DEL等位基因均是由1个核苷酸突变所引起的。DEL的遗传背景在中国人和欧洲白人之间存在明显差异。中国汉族人群中最为常见以及在过去很长时间的报道中表明中国汉族人群中只存在这种等位基因RHD1227A[13]。

60例RhD(-)样本经PCR-SSP实验共检测出:1例DVIⅢ型、5例弱D15 、7例1227DEL、9例 RHDCE(2-9)-D、38例RHD基因缺失[即为真正的RhD(-)]。其中RHD基因缺失所占阴性血液比率的63.33%,长春与云南等地区RHD基因缺失所占阴性血液比率没有显著性差异(P>0.05);RHD-CE(2-9)-D型所占阴性血液比率的15%,与2002年和2003年国内学者检测到的比率12%很接近[7,14]。说明这种表型的RhD(-)血液在国内还是比较常见的。1227DEL所占阴性血液比率的11.67%,与上海、新疆、日本地区比较无显著性差异[15-16]。但是与台湾、海南等地区差异较大[17-18]。基本接近于国内大部分地区。本实验检出1例DVIⅢ型,它形成的分子生物学机制是:RHD基因的第3-6号外显子被RHCE基因所取代产生融合基因,使得D抗原表达很弱,很不易被检出。此型一般多见于白种人和日本人,中国人群比较少见[1]。

由于目前RhD(-)基因变化尚处在研究阶段,对于RhD(-)表型血液临床应用还没有具体定论。但RhD(-)表型血液在临床有其重要意义。RhD(-)表型的血液一直被当作RhD(-)血使用。这种表型RhD(-)血液的输注方式,对于真正的RhD(-)患者存在潜在的危险,因为这种血液红细胞表面的极弱D抗原可能诱发RhD(-)患者产生抗D,从而增加溶血性输血反应的发生率;对于RhD(-)女性患者,输注这种血液,怀孕后发生新生儿溶血病的风险也随之增大。另一方面,RhD(-)表型患者输注真正的RhD(-)血则意味着血液资源的巨大浪费。因此,研究准确的RhD(-)基因的定型方法,对临床输血安全有重要意义。

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